E.stiedai阿拉尔株部分生物学特性的研究

为了研究斯氏艾美尔球虫（E．stiedai）阿拉尔株的生物学特性，试验以30～35日龄健康兔为研究对象，经口感染8．0×104个／只孢子化纯种E．stiedai卵囊，从感染后第10天开始，每天收集粪便进行卵囊计数，计算其最小潜在期和每克粪便的虫卵数（EPG），并采用常规方法测定卵囊最短孢子化时间和卵囊大小。结果表明：在染虫后第13天才从粪便中检出卵囊，之后卵囊排出量逐渐增多，至感染后第24天达到峰值，而后逐渐减少，至第40天几乎检不出；该虫株最短孢子化时间为33h，卵囊大小为36．4（31．3～38．7）μm×22．8（19．1～27．8）μm，卵囊指数为1．59。

E.stiedai对兔血清MDA含量和SOD活性及肝脏指数的影响

本试验以60只30~35日龄健康兔为研究对象,经口感染8.0×104个/只孢子化纯种E.stiedai卵囊,从感染后第1天开始,每2d收集粪便,进行卵囊计数,计算其OPG;于感染后5、10、15、20、25、30、35、40、45、50d剖杀动物,取其肝脏和血清,测定肝脏指数和血清中丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性。结果显示,在染虫后第13天才从粪便中检出卵囊,之后卵囊排出逐渐增多,至感染后第24天达到峰值,而后逐渐减少,至第40天几乎检不出;感染初期试验兔血清中MDA含量明显高于对照组水平（P〈0.05）,SOD活性有明显下降,两项指标在感染后期逐步恢复至对照组水平;试验组肝脏指数则随感染时间逐渐增大,表明球虫感染所致的肝脏病理氧化应激损伤了机体的抗氧化平衡,而机体的代偿功能可在一定程度上维持机体抗氧化能力。旨在为研究斯氏艾美耳球虫（E.stiedai）对兔血清抗氧化功能的影响提供理论基础。

E.stiedai感染兔免疫器官内球虫抗原的免疫组化定位

用免疫组化SABC法,对斯氏艾美耳球虫感染后兔肝脏、脾脏和肝门淋巴结中球虫抗原的分布进行了观察。结果表明,在肝脏窦状隙、胆管上皮细胞、肝门淋巴结和脾脏内可见到明显的呈棕黄色阳性反应区,表明在这些区域和部位有相应的E.stiedai孢子囊、裂殖子或子孢子抗原存在,且抗原数量以肝脏内最多,其次为脾脏,最少者为肝门淋巴结;显微镜下还可见到大量坏死的肝细胞、淋巴细胞以及朗罕氏巨细胞,说明多核巨细胞也参与了对球虫的吞噬和处理过程。

E.stiedai感染兔的肝、脾和外周血单核细胞TLR-2、4mRNA表达量的变化

通过已建立的兔TLR-2、4mRNA表达水平的SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法,对斯氏艾美尔球虫(E.stiedai)感染后的裂殖生殖期(感染后第8天)、排卵囊初期(感染后第15天)和排卵囊高峰期(感染后第21天),兔肝、脾和外周血单核细胞TLR-2、4mRNA表达水平进行检测。结果显示,TLR-2、4的RRT-PCR产物分别在82.3、79.0℃出现单特异峰,其相关系数分别为0.994 8、0.999 6,扩增效率分别为1.05、0.99。感染E.stiedai后,兔的肝、脾TLR2mRNA表达水平显著高于对照组(P<0.01),且在排卵囊初期最高;TLR4mRNA表达量在裂殖生殖期和排卵囊初期显著下调(P<0.01),而至排卵囊高峰期较对照组显著增加(P<0.01);3个阶段中兔外周血单核细胞TLR2和TLR4mRNA表达水平均显著低于对照组(P<0.01)。本研究提示TLR2和TLR4参与了兔体对E.stiedai的感染应答。

基于Gateway技术的E.stiedai孢子化卵囊cDNA表达文库构建

为深入研究斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)的分子生物学特征,揭示其与宿主细胞的互作及免疫机理,以E.stiedai阿拉尔分离株的新鲜孢子化卵囊为材料,采用Gateway技术分别构建了E.stiedai孢子化卵囊cDNA原核和慢病毒表达文库,并测定了文库质量。分析表明,表达文库平均插入片段大小为1.5kb,重组率为100%,慢病毒表达文库和原核表达文库容量分别为3.5×106,3.9×106 CFU/mL,符合高质量文库的标准,可用于进一步开展相关基因的克隆及功能研究,为研究E.stiedai的入侵及免疫机制奠定基础。

斯氏艾美耳球虫子孢子的移行途径

关于斯氏艾美耳球虫Ｅｉｌｎｅｒｉａｓｔｉｅｄａｉ（Ｓｐｏｒｏｚｏａ：Ｅｉｍｅｒｉｉｄａｅ）子孢子的移行途径争议尚大。作者借光镜和电镜互补的手段研究了子孢子从肠腔到肝内胆管上皮细胞的移行。所取材料为人工感染５～５０万卵囊的１月龄幼兔的血液、肠道、淋巴结、脾和肝，取材料时间为感染后２～７２ｈ（２ｈ的间隔）至４～６６（１６的间隔）。依据子孢子大量出现于肠系膜淋巴结和小量出现于脾脏而未见于其它部位淋巴结，以及肝内胆管周围营养血管（胆管周毛细血管丛）中有大量子孢子出现等观察结果，提出了子孢子移行途径的新假说，即子孢子进入肠固有层淋巴管、肠系膜淋巴结、经乳糜池转入血循环、由肝动脉至汇管区胆管周毛细血管丛并由此处侵入胆管上皮细胞。

斯氏艾美耳球虫的致病性及病理学研究

用纯种斯氏艾美耳球虫孢子化卵囊人工感染25只断奶幼兔,进行致病性和病理学研究。试验兔分为1个不感染对照组和4个感染组,各感染组每只幼兔分别口服感染2.0×103、1.0×104、5.0×104、2.5×105个孢子化卵囊。与对照组相比,接种2.0×103个和1.0×104个孢子化卵囊的两个感染组的平均病变记分、肝重指数、血清转氨酶活性有显著差异(P<0.05);接种5.0×104个和2.5×105个孢子化卵囊的两个感染组上述指标有极显著差异(P<0.01)。表明斯氏艾美耳球虫对幼兔具有很强的致病性,能导致严重的肝球虫病。

斯氏艾美耳球虫小配子的发育及其超微结构

结合光镜和电镜、切片和涂片技术 ,对斯氏艾美耳球虫 (Eimeriastiedai)小配子发育期的超微结构进行了研究。小配子发育分 2个阶段———生长与核分裂阶段及小配子的形成与分化阶段。早期小配子体单核 ,核仁小 ;随着核的分裂变为双核、四核和多核小配子体 ,后者因核极多 ,浅层分叶形成小配子体胚以利于核周边排列。各小配子体胚周边的核与嵌于核前方的线粒体向前突出并生长 ,最后分化形成小配子落入带虫空泡。成熟的小配子有 2根鞭毛、1个大线粒体和 1个强嗜锇性核、被单层膜。

斯氏艾美耳球虫ITS1-5.8S rRNA-ITS2序列的克隆及PCR检测方法的建立

通过对多种鸡球虫和松鼠球虫18SrRNA和28SrRNA进行序列比对分析,在18SrRNA 3′端和28SrRNA 5′端保守区设计艾美耳属通用引物,以斯氏艾美耳球虫洛阳分离株LY卵囊基因组DNA为模板首次成功克隆到斯氏艾美耳球虫完整的ITS1-5.8SrRNA-ITS2序列,其大小为1 178bp,其中ITS1序列长度为423bp,5.8SrRNA为155bp,ITS2为600bp,斯氏艾美耳球虫LY株ITS1/2序列高度变异,与鸡球虫、啮齿动物球虫的序列相似性低于60%。然后在斯氏艾美耳球虫ITS1/2序列超变区设计种特异引物,建立了灵敏、特异的PCR检测方法。本研究结果将为兔球虫强致病种的临床诊断和揭示兔球虫种群遗传特征提供有效的分子工具。

斯氏艾美耳球虫子孢子的超微结构

斯氏艾美耳球虫子孢子呈香蕉形，外被三层膜组成的表膜，有前后极环；顶复合器具典型结构，棒状体为８根；核一个，位于虫体前半部，含一个偏心核仁；相当于核中部水平位置的表膜上，见有一微孔；折光体在核后，呈球形，约占子孢子纵长的２／５；尾部常见一兔尾巴式的结构，构成方式类似阿米巴的伪足，是由被表膜的胞质向外突出形成的；胞质中见有许多管泡状线粒体和一些电子致密体。

斯氏艾美耳球虫MIC-5与兔IL-15基因在真核细胞中的共表达

【目的】构建能在真核细胞中共表达斯氏艾美耳球虫微线蛋白5(MIC-5)和兔IL-15重组载体,为进一步研究抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗奠定基础。【方法】将斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因,克隆到真核双表达载体pBudce4.1中,应用脂质体介导法将构建的重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞。在转染后,用RT-PCR法和间接免疫荧光试验(IFA)分别检测MIC-5和IL-15基因在BHK-21细胞中的转录和表达情况。【结果】在重组质粒pB-MIC-5-IL-15转染BHK-21细胞24 h后即可检测到MIC-5、IL-15基因进行了转录;在转染36、48、72h后,MIC-5和IL-15基因可同时在BHK-21细胞中表达。【结论】成功构建了含有斯氏艾美耳球虫MIC-5和兔IL-15基因的重组载体,实现了两种基因在真核细胞中的共表达,为抗斯氏艾美耳球虫的免疫调节性DNA疫苗研制奠定了基础。

斯氏艾美耳球虫孢子生殖及其致病性研究

目的采用单卵囊分离技术分离斯氏艾美耳球虫(Eimeria stiedai),观察其卵囊在孢子化过程中的发育形态变化。方法通过人工感染断奶幼兔,以潜伏期、死亡率、肝指数、血清中转氨酶数值、肝脏病变记分等指标研究其致病性。结果采用单卵囊感染技术成功分离了E.stiedai单卵囊,卵囊在29℃条件下最早孢子化形成时间为39 h,潜在期为13～15 d,感染率为20%。结论用继代增殖的纯株E.stiedai人工接种试验兔,在一定范围内其致病性随感染剂量的增加而增强。

斯氏艾美耳球虫大配子发育及其超微结构

凭借光镜和电镜、切片和涂片技术相结合之手段 ,作者对斯氏艾美耳球虫 (Eimeriastiedai)大配子发育及其超微结构进行了研究。大配子发育历经早、中、晚 (成熟 ) 3期。早期虫体以大核、大核仁和数个早期形态的成囊颗粒Ⅰ (WFⅠ )的出现为特征 ;中期虫体以成囊颗粒Ⅱ (WFⅡ )之出现为特征 ,含大量脂肪体和支链淀粉颗粒并出现小管构造 ;成熟期大配子体即大配子 ,被单层膜 ,WFⅠ和WFⅡ周边排列 ,含极多的脂肪体和支链淀粉颗粒 ,有一明显核仁的大核 ,小管构造增多。

斯氏艾美耳球虫裂殖生殖的多态现象

迄今描述的艾美耳科和住肉孢子虫科球虫的裂殖生殖多为单态，作者发现斯氏艾美耳球虫的裂殖生殖具多态性，其方式有：子孢子型裂殖体以内单多生殖方式产生下代裂殖子；双或多核的裂殖子型裂殖体或以内二多生殖方式或以外单多生殖方式产生下代裂殖子；单核裂殖子型裂殖体以外多多生殖方式产生下代裂殖子；经典型裂殖体以内单多和外单多混生方式产生下代裂殖子。这种裂殖体以多态的方式产生下代裂殖子的现象称为裂殖生殖的多态现象。依据前人以及作者的观察，作者提出两项建议：（１）将艾美耳科和住肉孢子虫科球虫的不同形态的裂殖体归为三型，即子孢子型、裂殖子型和经典型；（２）将此两科球虫的内生方式归为四型，即内单多生殖、内二双生殖、内二多生殖和内多多生殖；将外生方式归为三型，即外单多生殖、外二多生殖和外多多生殖；将斯氏艾美耳球虫的一种特殊生殖方式归为内单多和外单多混生殖。球虫裂殖生殖的多态性反映球虫遗传物质的多型性。

NOS底物、抑制剂及NO供体在兔斯氏艾美耳球虫感染时作用的研究

为了探讨兔斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)感染时试验家兔肝的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性和血清中NO浓度变化以及NO对兔球虫的抑制或杀伤作用,通过腹腔注射的途径给予感染E.stiedai的家兔不同浓度的NOS底物L-精氨酸(L-Arg)、NO供体硝酸甘油(GTN)和iNOS抑制剂L-氨基胍(L-AG),利用NOS活性测试盒测定肝的iNOS活性,用硝酸还原酶法测定血清中NO的浓度,采用麦克马斯特氏法计数每克粪便的球虫卵囊数(OPG),根据试验兔肝的剖检和镜下病变来进行病变计分。结果表明:感染E.stiedai后,家兔肝匀浆的iN-OS活性和血清中NO浓度逐渐升高,感染对照组、添加L-Arg组、GTN组、L-AG组4组均在感染后第12 d达到最高值,而后逐渐下降,于23 d左右下降到感染前的水平;L-Arg可增强肝的iNOS活性,使其释放大量NO,产生对球虫的抑制或杀伤作用,减轻球虫感染引起的病变;硝酸甘油可在兔体内释放NO,对球虫产生一定的抑制作用,稍减轻球虫感染引起的病变;相反,L-AG则抑制肝的iNOS活性,使生成的NO减少,对球虫的抑制作用减弱甚至消失,从而加重球虫感染引起的病变。结果提示:NO及iNOS确实参与了家兔E.stiedai的感染过程,并且NO在球虫感染过程中起到了抑制或杀伤球虫的作用。

斯氏艾美耳球虫感染对兔肝脏和血清抗氧化功能的影响

为研究斯氏艾美耳球虫对兔肝脏及血清抗氧化功能的影响,本实验以30日龄～45日龄兔为研究对象,测定兔接种斯氏艾美耳球虫后,血清和肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和过氧化氢酶(CAT)的活性及丙二醛(MDA)含量。结果表明:感染斯氏艾美耳球虫后,SOD、CAT和GSH-Px的活性均有不同程度的下降,MDA含量高于对照组水平,各指标在感染急性期后逐步回升至对照组水平。表明病理氧化应激参与了球虫感染过程,损伤了机体的抗氧化平衡,同时其变化规律也符合球虫自限性感染的特点。

斯氏艾美耳球虫感染兔血常规及肝脏功能分析

为了对斯氏艾美耳球虫感染兔的血常规、肝功能和凝血4项进行检测分析。通过孢子化的斯氏艾美耳球虫卵囊口服接种的途径感染8只2月龄的无球虫新西兰兔,8只不感染的设为阴性对照组。感染30 d后,心脏采血采集血液样本,测量血常规、肝功能和凝血4项等血液指标。血液检测结果显示,与肝功能相关的8项指标中,仅有谷氨酰肽转移酶、血清胆碱酯酶差异显著,其余均差异极显著,血常规和凝血4项亦差异极显著。表明兔感染斯氏艾美耳球虫1个月后肝功能严重受损。

斯氏艾美耳球虫细胞化学的研究

本文用组织化学技术对斯氏艾美耳球虫内生阶段和子孢子的细胞化学进行了研究。结果发现,多糖存在于第二代裂殖体、大配子体、大配子、合子、未孢子化卵囊和子孢子内。脂肪存在于第二代A型裂殖体、大配子、合子、未孢子化卵囊及子孢子内。整个内生发育阶段的虫体和子孢子均含有蛋白质。两型裂殖体、大、小配子体、合子和子孢子内均有Feugan反应阳性的DNA存在,而RNA存在于整个内生阶段和子孢子中。内生阶段虫体和子孢子均有ACP和SDH,然而ALP只存在于内生阶段,子孢子缺乏。

L-精氨酸和L-氨基胍在兔斯氏艾美耳球虫感染中作用的研究

为了探讨兔斯氏艾美耳球虫(E.stiedai)感染兔肝脏诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性和血清NO浓度变化以及NO对兔球虫的抑制或杀伤作用,以腹腔注射途径给予球虫感染家兔一氧化氮合酶(NOS)底物L-精氨酸(L-Arg)和iNOS抑制剂L-氨基胍(L-AG),对家兔球虫感染时肝脏iNOS活性、血清NO浓度、每克粪便的球虫卵囊数(OPG)、肝的剖检和镜下病变及其病变计分进行了研究。试验结果表明:①家兔感染E.stiedai后,肝匀浆的iNOS活性和血清中NO浓度逐渐升高,感染对照组、添加L-Arg组和添加L-AG组3组均在感染后第12天达到最高值,而后逐渐下降,于23 d左右下降到感染前的水平;②L-Arg可增强iNOS的活性,促进体内大量生成NO,进而提高家兔对球虫的抑制作用,减轻球虫感染引起的病变;L-AG则降低iNOS的活性,使体内生成的NO减少,从而加重球虫感染引起的病变。结果提示:NO及iNOS确实参与了家兔E.stiedai的感染过程,并且NO在球虫感染过程中起到了抑制或杀伤兔球虫的作用。

斯氏艾美耳球虫体外脱囊过程中孢子囊余体的形态学和组织化学研究

本研究观察了斯氏艾美耳球虫Eimeria stiedai子孢子体外脱囊过程中孢子囊余体的变化,并用组织化学技术研究了其化学特性。发现在子孢子脱囊的初期,即斯氏体离去和子孢子脱出之前,孢子囊余体已分散到整个孢子囊内,呈颗粒状,运动性强。第1个子孢子脱出后,余体颗粒密集于第2个子孢子周围,活动剧烈。脱囊完成后,余体颗粒向一起集中,在孢子囊钝端形成圆球状体,周围似乎有膜包围,此时巳失去运动性。组织化学研究证明,斯氏艾美耳球虫孢子囊余体含有多量的多糖、脂肪及蛋白质。同时还发现,孢子囊余体内有较强的酸性磷酸酶活性。