柔嫩艾美耳球虫孢子化7小时卵囊中的Etmic-2基因克隆及测序

作者根据子孢子微线基因(Etmic-2)的 cDNA 序列,利用计算机设计出一对引物,从孢子化7h 卵囊中用 RT-PCR 技术扩增出1个片段(mic2～7h).把这个片段克隆到 pGEM-T-Easy Vector 中后,我们得到一个阳性克隆 pmic2～7h.酶切分析证明 pmic2～7h 含有 mic2～7h,并且外源片段以反方向插入 T 载体中.核苷酸序列测定结果表明 mic2～7h 比 Etmic-2基因至少长111bp.但这多出的111bp 并没有造成基因读框错位,也没有造成基因读框终止.这111bp 由2部分组成,一部分长42bp,另一部分长69bp.虽然这二个片段的3′端均有典型的真核生物 mRNA 内含子剪切信号,但5′端却没有内含子的剪切信号点.这说明多出来的111bp不是内含子序列,mic2～7h 基因也不是 Etmic-2基因的前体,而可能是 EtMIC-2的一种蛋白异形体基因.

柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的Etmic-2基因克隆及测序

作者根据子孢子微线基因 (Etmic- 2 )的 c DNA序列 ,利用计算机设计出 1对引物 ,从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中用 RT- PCR技术扩增出 1个片段 (m ic2 - m z)。把这个片段克隆到 p GEM- T- Easy Vector中后 ,我们得到 1个阳性克隆 pmic2 - mz,酶切分析证明 pm ic2 - m z含有 m ic2 - m z,并且外源片段以反方向插入 T载体中。核苷酸序列测定结果表明 m ic2 - m z与 Etmic- 2基因的编码区序列一样长 ,分子量都为 112 7bp,并且两序列之间也只有 3个碱基不同 ,也没有造成氨基酸编码错位 ,这说明球虫从子孢子到第二代裂殖子的二次无性生殖过程中 ,微线基因Etm ic- 2 c NDA序列没有发生太大的变化。

鸡柔嫩艾美耳球虫特异性抗体EtMIC4-N蛋白BAS-ELISA检测方法的建立

为了检测柔嫩艾美耳球虫感染鸡血清中特异性抗体水平,原核表达纯化EtMIC4-N蛋白,采用免疫印迹法确定其反应原性,再以纯化后的蛋白为包被抗原,以生物素标记的羊抗鸡IgG为二抗,以HRP结合链霉亲和素为酶标抗体,建立了检测柔嫩艾美耳球虫抗体的BAS-ELISA方法。经检测,EtMIC4-N蛋白最佳包被浓度为7μg/mL,最适封闭液为1%BSA,最佳血清稀释度为1:80,二抗稀释度为1:100000,酶标抗体稀释度为1:100000,最适显色时间为15min,组内和组间变异系数均小于10%。通过动物感染试验验证,结果表明建立的BAS-ELISA可以用于检测柔嫩艾美耳球虫特异性抗体的检测,并且具有简便,快速,灵敏,成本低等特点。

间接血凝检测鸡柔嫩艾美耳球虫血清抗体方法的建立

为了快速检测免疫球虫后宿主血清中特异性抗体的水平,以DE-52层析纯化子孢子、裂殖子,超声裂解获取可溶性蛋白;原核表达EtMIC4-N蛋白,致敏戊二醛醛化后的红细胞,以人工免疫柔嫩艾美耳球虫后分离的血清为阳性血清,以SPF鸡分离的血清为阴性血清,建立柔嫩艾美耳球虫间接血凝试验。结果显示,稀释度为1:2万鞣酸处理戊二醛醛化后的红细胞,使用100μg/mL可溶性裂殖子、子孢子蛋白或12.5μg/mL表达的重组蛋白EtMIC4-N均可以与阳性血清发生反应(可达1:1024),与鸡的阴性血清及大肠杆菌病的阳性血清无反应.与堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫阳性血清有微弱反应(不超过1:8)。试验证明,该方法具有简单、方便、快捷、灵敏等优点。

堆型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫卵囊最短孢子发育时间的测定

将收集到的新排出的堆型艾美耳球虫（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）与柔嫩艾美耳球虫（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）卵囊于２９℃静态系统中孢化。以３０ｍｉｎ为间隔，对卵囊孢子发育的４个阶段在显微镜下进行观察。以１ｈ为间隔，用发育中的卵囊连续接种无球虫鸡，以确定最短孢子发育时间（ＭＳＴ）。对影响孢子发育的外部因素进行了初步探讨。用堆型艾美耳球虫比较不同卵囊浓度，不同悬液深度在印囊孢化过程中第２０ｈ时子孢子形成的卵囊百分率。Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ与Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ的ＭＳＴ分别为１１ｈ与１８ｈ。印囊浓度和悬液深度与孢子发育时间里明显反比关系。