枇杷叶片发育基因EjGRF5与启动子克隆及其在不同倍性枇杷中的表达

【目的】克隆并解析枇杷(Eriobotrya japonica(Thunb.)Lindl.)中参与调控叶片生长发育的EjGRF5及其启动子序列的结构特征,研究其在不同倍性枇杷中的表达特性,为进一步研究该基因调控不同倍性枇杷叶片生长势差异的机理奠定基础。【方法】从转录组测序数据中挖掘枇杷EjGRF5的参考序列,以此序列设计引物,并以‘龙泉1号’四倍体枇杷基因组DNA为模板扩增EjGRF5全长,参照EjGRF5参考序列获得其CDS序列。利用Bioedit7.2及Signal P4.1对EjGRF5的CDS序列及其蛋白的理化性质进行分析;采用Mega7.0软件构建EjGRF5和其他物种GRF5的系统进化树;采用Loc Tree3及Soft Berry Prot Comp9.0在线软件对EjGRF5蛋白进行亚细胞定位预测;采用染色体步移的方法克隆EjGRF5的启动子序列,并利用Plant CARE在线软件对克隆得到的EjGRF5启动子序列进行生物信息学分析;采用RT-PCR技术对EjGRF5在三倍体枇杷及其亲本(4x、2x)中的表达差异进行初步分析。【结果】将测序结果与转录组测序的参考序列进行比对发现,EjGRF5全长为1 386 bp,含有3个外显子,2个内含子,内含子全长399 bp,CDS全长987 bp。进化树分析表明,枇杷EjGRF5与蔷薇科的其他植物高度同源,且与白梨的亲缘关系最近。亚细胞定位预测结果显示,枇杷EjGRF5蛋白定位于细胞核中。启动子分析显示,EjGRF5启动子区域含有多个顺势作用元件,包括脱落酸、乙烯、高温、厌氧诱导、赤霉素和光响应元件,并且光响应元件多达11个。qRT-PCR结果显示,除F1代A-6和B-3外,其余三倍体子代EjGRF5表达量相对于中间亲本值(MPV)都发生了不同程度的上调,其中A-3的表达量是其MPV的20倍,A-5表达量是其MPV的18倍左右。【结论】获得了与枇杷叶片生长发育相关的EjGRF5、CDS序列及其启动子序列,EjGRF5在三倍体枇杷叶片中的表达呈现出上调趋势。