STUDIES ON A SPECIFIC ELECTROFUSION METHOD TO PRODUCE McAbs

The positive rate of hybridomas is low in routine McAb(monoclonal antibody)preparation because of non-selective cell fusion,thus bringing about a lot of heavy work load in screening. Meanwhile, it is not easy to obtain McAbs with high affinities to the administered antigen. These years, M.S. Lo et al. and Don M. Wojchowski et al. established two specific elec-

分泌抗包虫囊液抗原McAb杂交瘤细胞株的建立

应用Oriel法制备的包虫囊液抗原经腹腔注入供实验的小鼠,作为脾细胞供体。此脾细胞与不能分泌的骨髓瘤细胞株SP2/0和P3u_1相融合,以生成杂交瘤细胞株。用ELISA法从这些混合细胞培养基中筛选出上清液,用稀释法将上清液克隆,再克隆化之后,生成能分泌单克隆抗体、抗包虫囊液活性的杂交瘤,其染色体数目在80～100范围之内。单克隆抗体类及亚类13Fs和31G_(12)分别是IgG_1和IgA。DD和ELISA用于鉴定它们的敏感性和特异性。应用ELISA法比较杂交瘤和绦虫囊尾蚴液等其它寄生虫抗原制备物,包虫囊液和Pf抗原,表明单克隆抗体对包虫囊寄生虫有很高的特异性。

粒细胞集落刺激因子及其McAb的研究

利用B细胞杂交瘤技术,用rhG-CSF免疫BALB/c小鼠,将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,成功地建立了3株能持续分泌特异抗rhG-CSF McAb的杂交瘤细胞。取其中2D_4-B_4杂交瘤细胞进行染色体数目测定,并将2D_4-B_4瘤细胞注入小鼠腹腔,获得抗体阳性腹水,测定提纯抗体IgG亚型、特异性、稳定性和亲和力,证实该McAb可以和hG-CSF及小鼠G-CSF特异结合。为进一步研究hG-CSF和人工合成G-CSF打下良好的基础。

分泌抗人IgMμ链McAb杂交瘤细胞株的建立

本文从正常人（HBSAg阴性）血清中分离纯化人IgM，以此作为抗原免疫BALB／C小鼠，根据kohler和Milstein杂交瘤细胞建株原理，采用本室建立的常规方法，将免疫脾细胞和小鼠SP2／0骨髓瘤细胞进行融合，建立了分泌抗人IgMμ链单克隆抗体杂交瘤细胞株。经过间接ELISA双向琼脂扩散试验及封闭试验等方法证实，所分泌的抗体为抗人IgMμ链McAb，其中3A4、3D32株杂交瘤细胞经反复冻存、复苏及多次传代，均能分泌高效价抗体，且为IgG1亚类。本实验结果为抗人IgM鼠队嵌合抗体基因的构建奠定了基础。

抗人VEGF受体Ⅱ胞外Ⅲ区单克隆抗体的制备

目的 制备人血管内皮细胞生长因子受体Ⅱ (Kinaseinsertdomaintontainingreceptor,KDR)胞外Ⅲ区的单克隆抗体 (McAb) ,探讨其抑制VEGF诱导的体外活性。方法 在大肠杆菌中表达重组KDR胞外Ⅲ区融合蛋白。融合蛋白经抗E tag柱分离纯化后免疫Balb/c小鼠 ,采用传统杂交瘤技术制备抗KDR胞外Ⅲ区McAb ,采用ELISA和Western免疫印迹鉴定其亚类和抗原结合特异性 ,并测定单克隆抗体对VEGF1 65刺激脐静脉内皮细胞株ECV30 4增殖的中和活性。结果 成功筛选出一株能稳定分泌抗KDR胞外Ⅲ区单克隆抗体的杂交瘤细胞株 (1D3) ,其分泌抗体亚类为IgG1。该McAb可明显阻断VEGF1 65对脐静脉内皮细胞株ECV30 4的刺激增生作用。结论 抗人血管内皮细胞生长因子受体KDR胞外Ⅲ区McAb可通过封闭KDR而抑制VEGF活性 ,McAb

应用生物反应器大规模培养杂交瘤细胞生产体内治疗用WuT3单克隆抗体

用3．5L和14L生物反应器培养WUT3杂交瘤细胞，结果表明用人血清可以代替牛血清培养WuT3细胞，在1％人血清培养液中添加适当营养成分，可达到10％小牛血清浓度下的细胞浓度（1．5×106／ml）和单抗产量（大于50μg／ml）。放大到75L生物反应器中采用半连续方式培养，建立了中试培养工艺流程和质控点，收获时细胞浓度为1.0×106～1．5×106／ml，单抗产量为40～70μg／ml，平均日产单抗达1g。在3．5L、14L、75L逐级放大培养过程中，细胞支原体为阴性，收获上清中单抗免疫活性合格，热原试验合格。

分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

采用单克隆抗体制备技术，建立了分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，液氮保存4年后复苏，细胞在HAT选择培养基中生长旺盛，分泌抗体稳定，分别命名为YNF1，YNF2，YNF3，YNF4，杂交瘤细胞染色体数介于96～115条。细胞培养上清和腹水的单抗间接ELISA效价分别为1：80～1：160和1：5000～1：10000。在间接ELISA和夹心ELISA检测中单抗与猪瘟病毒呈特异性反应，与正常的猪、兔肾组织提取液及其血清Ig无交叉。抗体蛋白属IgG类，亚类及轻链分别为IgG1／λ，IgG2a／κ，IgG2a／λ，IgGl／λ。结果表明，4株杂交瘤是分泌抗猪瘟病毒单克隆抗体的细胞株，可长期传代无限分泌单抗，是进一步研究猪瘟病毒和开发敏感、特异、快速诊断猪瘟试剂盒和试纸探针的免疫学特异性试剂来源。

鼠抗HCV单克隆抗体研制及初步应用探讨

交联HCV 合成多肽抗原,用鼠一鼠杂交瘤技术获得8株稳定分泌抗HCV 的特异性单抗,分别命名为YLCV 系1—8。经初步研究结果表示,抗HCV 抗体阳性血清可抑制酶标YLCV-1和YLCY-5单抗与抗原的反应。抗原测定结果6份血清中有一份呈强阳性反应,由此提示单抗在HCV 抗体抗原检测系统中应用的可能性,同时为HCV 抗原成份的分析提供了必要的条件.

丁酸钠对杂交瘤细胞增殖及抗体分泌的影响

用含不同浓度丁酸钠完全培养液和无血清培养液培养分泌抗组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)单克隆抗体的杂交瘤细胞。当丁酸钠浓度为0.25～0.5 mmol/L时,对杂交瘤细胞分泌抗体能力具有刺激作用,提高抗体效价2～4倍,对细胞生长无抑制作用。表明丁酸钠可作为一种添加剂用以提高杂交瘤细胞分泌抗体的能力。

人心肌肌钙蛋白T单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

目的 :建立抗人心肌肌钙蛋白T(cTnT)单克隆抗体 (McAb)的杂交瘤细胞株。方法 :从人心肌组织中提取纯化人cTnT ,免疫BALB/C小鼠 ,采用杂交瘤技术 ,间接ELISA法选择能稳定分泌抗cTnTMcAb的杂交瘤细胞株。结果 :建立了 2株稳定分泌抗cTnTMcAb的杂交瘤细胞株N15C和N16D ,其染色体数目为 90～ 10 6 ,McAbIg亚类均为IgG1,间接ELISA法测定McAb腹水效价分别为 1 80 0 0和 1 32 0 0 0。免疫印迹结果显示 2株McAb均可识别cTnT中Mr 为 370 0 0的单一区带 ,不识别人骨骼肌提取物。间接ELISA法测定N15C和N16DMcAb与cTnT反应的最低浓度分别为 4 7μg/L和 2 3μg/L。相加试验表明 2株McAb能识别不同的抗原表位。 结论 :获得

应用光敏生物素标记探针检测杂交瘤细胞中小鼠白血病病毒

采用BamHⅠ酶切和琼脂糖凝胶电泳技术，从重组质粒pSF11中回收5kb小鼠白血病病毒（MuLv）DNA片段，用光敏生物素标记制备DNA探针，采用斑点杂交法检测杂交癌细胞，McAb纯品以及SP2／0细胞中的MuLv。结果表明，此探针特异性好，灵敏度可达25pg。在检测的13株杂交瘤细胞和2株SP2／0细胞中分别有5株和1株为MuLv阳性，在McAb纯品中未查出MuLv。

克伦特罗单克隆抗体的制备及其初步鉴定

【研究目的】制备克伦特罗单克隆抗体(McAb),为建立克伦特罗残留检测方法奠定基础。【方法】用偶氮化法将克伦特罗与钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)及卵清白蛋白(OVA)偶联,制备完全抗原,免疫Balb/c小鼠,建立杂交瘤细胞株以制备单抗,并对单抗的特异性、交叉反应性及抗原识别位点等特性进行了初步鉴定。【结果】获得了1H5、1H7、1D6、2F10四株杂交瘤腹水效价均在1:105以上。对沙丁胺醇交叉反应性测定,最小的是1D6,只有2.32%的交叉反应性。单抗相对亲和力1D6>1H5>1H7>2F10。抗原识别位点分析结果表明,这四株单抗至少识别两个不同的抗原位点。选用1D6初步建立了竞争ELISA检测方法,检测限可达1ng/ml,为进一步研制残留检测试剂盒奠定了基础。

抗rhTNFα杂交瘤细胞的体外培养及抗体分泌的研究

采用非CO2依赖培养基（CO2-IM）在无CO2、37℃条件下培养抗rhTNFα杂交瘤细胞，培养1周PH无显著变化，细胞生长趋势和抗体分泌显著超过DMEM。将CO2－IM与SFPF－HM混合后添加ITSE可以培养抗rhTNF杂交瘤细胞，其细胞生长速率、密度、活力和抗体产量均达到或超过含血清培养。

抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究

目的建立分泌抗华支睾吸虫代谢抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法用华支睾吸虫成虫代谢抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合,筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株,测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价,检测单抗与日本血吸虫全虫可溶性抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应。结果获得3株分泌高滴度抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应,3株单抗均属IgG。结论制备的抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗,为制备免疫诊断试剂盒奠定了基础。

抗兔晶状体上皮细胞单克隆抗体的制备及特异性研究

目的 为防治白内障术后因晶状体上皮细胞增殖而产生的后发性白内障 ,制备抗家兔晶状体上皮细胞的单克隆抗体 ,从而更进一步以其为载体与细胞毒素偶联 ,特异性抑制晶状体上皮细胞生长而不损伤眼内其他组织 ,为防治后发性白内障奠定实验基础。方法 应用家兔晶状体上皮细胞与佐剂混合 ,免疫 BAL B/ c小鼠 ,通过聚乙二醇 (PEG -40 0 0 )使被免疫的小鼠脾细胞与同系小鼠骨髓瘤细胞融合 ,细胞融合之后 ,经过 HAT选择性培养液培养 ,用间接免疫荧光抗体法和免疫组化 SP法检测杂交瘤细胞上清夜中的抗体 ,筛选出呈阳性反应的杂交瘤细胞 ,再经 3次甲基纤维素克隆化培养以保证单克隆抗体的特性 ,最后将此单克隆抗体对人眼组织进行交叉反应。结果 被免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞 SP2 /0通过 PEG-40 0 0融合后 ,经 HAT选择性培养 ,16 d后杂交瘤细胞克隆产生 ,对其进行 3次甲基纤维素培养基克隆化培养 ,获得检测抗体阳性率达 10 0 %的克隆系为一株。用免疫组化 SP法检测此抗体仅对兔晶状体上皮细胞抗原呈阳性反应 ,而对兔眼角膜、虹膜、人眼角膜、虹膜、晶状体上皮细胞呈阴性反应。结论 成功制备了抗家兔晶状体上皮细胞的单克隆抗体 ,此单克隆抗体具有较强的特异性 ,对人眼组织无交叉反应 。

抗华支睾吸虫单克隆抗体的制备和鉴定

目的：建立分泌抗华支睾吸虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株并进行鉴定。方法：用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫虫卵抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位。结果：获得５株分泌高滴度抗华支睾吸虫成虫单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应；５株单抗均属ＩｇＭ；单抗所识别的抗原定位于华支睾吸虫肠管壁。结论：制备的抗华支睾吸虫成虫的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立

在MDBK细胞上增殖牛病毒性腹泻病毒(BVDV)HN 1 株,用蔗糖密度梯度离心法纯化后免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞并与NS0 骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选,3次有限稀释法克隆,得到4株能稳定分泌抗BVDV单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株:3A8、3C7、3C11和3E9。经鉴定,3A8、3C7、3E9株为IgG1亚类,3C11株为IgG2a亚类;杂交瘤细胞的平均染色体数目为99 条。3A8、3C7、3E9、3C11 与BCV、BRV均无交叉反应,但3A8、3C7、3E9与HCV、BDV存在交叉反应,而3C11与HCV、BDV无交叉反应,3C11显示出较好的特异性;杂交瘤细胞培养上清液及小鼠腹水McAb的ELISA效价分别为1∶1 000 和1∶200 000,该杂交瘤细胞连续培养20代后仍能稳定分泌抗体。这些McAb的获得为BVDV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。

新颖抗猪流行性腹泻免疫制剂

以新生乳猪增殖猪流行性腹泻病毒（PEDV），通过蔗糖密度梯度离心纯化，获得结构较为完整的病毒颗粒，病毒ELISA效价为1：3×105，蛋白含量为3．96mg／mL．将提纯的PEDV免疫Balb／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞进行融合．融合率为95．6％。用间接ELISA筛选并进行3次再克隆，阳性率达100％，共获用15株能稳定分泌特异性抗PEDV单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞．其染色体数平均为90～100．所分泌抗体具有高度特异性，腹水ELISA效价为1：103～1：106。用混合单抗对新生猪的保护试验证明，这些单抗不论在体内或体外．对PEDV均有中和作用．试验绪可以得到抗体的保护耐过不死，而病毒对照组的猪只全部死亡。将混合单抗用于PED的发病场，保护率达91％．建立了PPA－ELISA、McAb阻断ELISA及MCAb免疫荧光试验等快速诊断方法．

无蛋白培养中杂交瘤细胞的生长与单克隆抗体分泌

目的 建立应用无蛋白培养基大量制备单克隆抗体 (McAb)的生产方法。方法 本实验以 3株猪瘟病毒特异单抗杂交瘤细胞为研究对象 ,通过与常规的有血清培养法比较 ,研究了无蛋白培养基中杂交瘤细胞的生长特性、抗体分泌效率、活性与纯度。结果 无蛋白培养基中单抗的产量与效价比有血清培养的单抗高 2～ 4倍 ,而且单抗的纯度显著提高。结论 无蛋白培养基可完全取代常规的有血清培养基 ,用于生产高滴度、高纯度单克隆抗体。

金霉素单克隆抗体的制备及检测方法的建立

采用羰基二咪唑法,将半抗原金霉素(AM)分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联制备金霉素免疫抗原AM-BSA和检测抗原AM-OVA,通过紫外光谱扫描检测偶联产物。采用细胞杂交瘤技术,制备抗金霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株,建立了金霉素竞争ELISA检测方法,其灵敏度达到50ng/ml,且呈现良好的线性关系(r=0.9812),并且与其他抗生素无交叉反应。