大蒜根腐病病原菌Alternaria embellisia DS55-6F的分离鉴定及其生长特性研究

大蒜是药食两用的百合科葱属作物,虽然具有抗肿瘤、抑菌等作用,但是连续种植后,常出现根部腐烂的现象。从山东省济宁市金乡县大蒜腐烂根样品中分离获得菌株DS55-6F,通过ITS、EF-1和gpd多基因分子生物学鉴定和形态学鉴定,明确该菌株为艾氏链格孢Alternaria embellisia;温室条件下,将该菌株回接大蒜幼苗,40 d后大蒜发生严重根部腐烂,通过重新分离和鉴定获得DS55-6F,符合柯赫氏验证试验,说明菌株艾氏链格孢Alternaria embellisia DS55-6F是大蒜根腐病病原菌。通过不同温度、不同pH、不同碳源、不同氮源4项指标对其生长特性进行评价,发现该菌株在28℃、pH 6、唯一碳源为麦芽糖、唯一氮源为牛肉浸粉或硝酸钾时菌丝生长较好,唯一碳源为乳糖、唯一氮源为硫酸铵或氯化铵时菌丝生长缓慢。

沙漠药用植物沙蒿内生真菌Embellisia chlamydospora中酚酸类化合物研究（英文）

从荒漠药用植物沙蒿的内生真菌Embellisia chlamydospora中首次分离得到3种酚酸类化合物,分别为barceloneic acid A(1),barceloneic lactone(2),2′-O-methyl-barceloneate(3)。根据其NMR与HR-ESI数据以及相关文献比对,确定了3个化合物的结构。活性试验结果证实化合物2和3显著抑制拟南芥根生长。目前,从E.chlamydospora真菌中仅分离出2种化合物terpestacin和embellistatin。本实验结果丰富了该真菌的化学成分多样性,进一步暗示特殊生境的植物内生真菌是产生结构新颖与活性显著的次级代谢产物的重要宝库。

埃里格孢的生物学特性及致病性初步研究

从患病鳜鱼鳃部分离到1个菌株,通过分子鉴定和形态鉴定,初步鉴定为埃里格孢(Embellisia allii)。将该菌株在不同温度和不同p H值条件下培养,根据二者对其生长速率的影响来进行生物学特性初步研究;再以草鱼和鲤鱼为感染对象,用该菌进行回复感染,对其致病性作初步研究。结果表明:埃里格孢在p H值为5.0~11.0下均能生长,以p H值为9.0~11.0时生长最佳;在5~35℃时,该菌都能生长,以20℃时生长最快,温度为40℃时该菌几乎不能生长。在实验室条件下,单一菌株对草鱼和鲤鱼不具有致病性。

西藏3种疯草中合成苦马豆素内生真菌的鉴定

【目的】从西藏毛瓣棘豆、冰川棘豆、茎直黄芪中分离内生真菌。【方法】应用薄层色谱法、气相色谱、气相色谱-质谱联用法检测内生真菌中的苦马豆素(swainsonine,SW),筛选可生成SW的内生真菌;应用聚合酶链反应对真菌的ITS序列和IGS序列进行扩增,并根据ITS序列信息构建系统发育树,确定其种属分类;对IGS序列进行限制性酶切,并分析酶切产物。【结果】从3种疯草中分离到可以产生SW的4株内生真菌,各菌的形态、ITS序列的同源性与埃里格孢属真菌较为接近,系统发育分析表明4株真菌均为棘豆埃里格孢菌。ITS序列和IGS序列的限制性片段的分析表明,4株真菌遗传距离较近,但仍存在种间变异,可能为棘豆埃里格孢菌的不同亚种。【结论】本研究结果为探讨内生真菌合成SW机理研究奠定了基础,为动物疯草中毒病的防除和疯草资源的合理利用提供了新思路。

甘肃棘豆中产苦马豆素内生真菌的分离与鉴定

【目的】确定甘肃棘豆中是否存在产生苦马豆素(SW)的内生真菌。【方法】对甘肃棘豆的内生真菌进行分离,应用薄层色谱法和气相色谱-甲基化--αD-甘露糖苷内标法分别对菌丝中SW进行检测,筛选可生成SW的疯草内生真菌;通过形态学观察,应用聚合酶链反应对5.8S rDNA-ITS序列进行扩增,并对扩增序列进行分析,构建系统发育树,对其进行种属分类。【结果】筛选出1种可以产生SW的甘肃棘豆内生真菌FEL3,气相色谱内标法测得其菌丝中SW含量为400.52μg/g。根据形态学、5.8S rDNA-ITS序列分析结果和文献报道,确定FEL3为埃里格孢属真菌。【结论】甘肃棘豆中存在生成SW的内生真菌Embellisiasp.FEL3。

基于rDNAITS序列分析Alternaria与相似属的关系及A.leucanthemi的分类地位

对Alternaria,Stemphylium,Ulocladium,Nimbya,Embellisia等五个形态相似属的代表性种进行了5.8S/ITS区段序列测定,连同从GenBank下载的相关有性型Pleospora,Lewia的同项资料,由Neighbor-joining方法构建系统发育树。序列对比结果显示,所有参试的菌株/种的5.8SrDNA序列保守程度较高,ITS序列变化较大,ITS1比ITS2变化更大。由5.8S/ITS构建的系统发育树可以足够将供试菌区分到属;系统发育树显示Alternaria,Ulocladium,Nimbya和Embellisia系统学关系较近,又存在一定的分化;Stemphylium聚在相对较远的分支上,与上述四属关系较远,相对独立进化;有性型的Pleospora与无性型的Stemphylium被聚到一个分支,这种不同阶段菌株在遗传基础上的一致,充分证明所用方法及所选测序的rDNA区段对本类群真菌的分类很有价值。Alternarialeucanthemi位于系统发育树的外侧,较为独立进化,与Alternaria的其它种亲缘关系较远,却与Stemphyliumspp.和Bipolarisspp.关系较近,对其目前的分类地位提出质疑。

疯草内生真菌研究进展

疯草含有疯草毒素,动物采食后能引起以慢性神经机能紊乱为特征的中毒病,是世界范围内危害草原畜牧业最严重的毒草之一。对疯草主要有毒成分苦马豆素来源问题的研究发现,疯草内生真菌与苦马豆素之间具有极为密切的关系。近年来,科研工作者对多种疯草的内生真菌进行分离,并对其与疯草的相互关系进行了深入研究。论文主要介绍了近年来国内外有关疯草内生真菌的种群分布特点、传播方式及疯草与内生真菌之间相互关系的最新研究进展,并对今后研究的重点领域如内生真菌生物学与分类学特性、疯草与内生真菌的关系以及苦马豆素药用活性等进行了展望。

基于gpd基因的大蒜黑腐病菌实时荧光定量PCR鉴定技术

【目的】大蒜黑腐病菌(Embellisia allii(Campanile)Simmons)的检疫鉴定主要采用形态鉴定方法。不仅耗时长,而且大蒜黑腐病菌与本属其他种以及其他属的分生孢子非常相似,极难分辨,需要建立快速、有效的分子诊断方法。研究旨在建立实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,q PCR)体系以准确、灵敏地鉴定大蒜黑腐病菌。【方法】从NCBI的Gen Bank数据库中,选取大蒜黑腐病菌和其他大蒜病害以及近似种的3-磷酸甘油脱氢酶(gpd)基因核酸序列数据15种,应用引物设计软件Primer express,根据探针设计原则从理论上选出1条探针和3对引物。根据试验结果对上述引物进行筛选,筛选出能够鉴定出大蒜黑腐病菌的特异性引物对和Taq Man探针。同时对反应体系中复性-延伸温度的反应参数进行优化,设计56、58、60℃3个温度梯度;将大蒜黑腐病菌基因组DNA在紫外核酸分析仪上进行定量后进行10倍的梯度稀释,对探针灵敏性进行测试,从而建立大蒜黑腐病菌Taq Man水解探针法q PCR检测体系。【结果】从基于Gen Bank上的15种gpd基因核酸序列设计的引物和探针中,筛选出能够鉴定大蒜黑腐病菌的特异性引物对Emb21/Emb32和Taq Man探针Emb。在供试的6种菌株中,只有靶标菌大蒜黑腐病菌利用该引物对和探针能够被特异性的检测到阳性,空白对照和其他参试菌均没有荧光信号的增加,检测为阴性。复性-延伸温度反应参数优化中,△Rn荧光信号增加值在58℃时达最大,56、60℃荧光信号增加值降低,经过多次重复试验,确定最佳的复性-延伸温度为58℃。灵敏度测试中,大蒜黑腐病菌DNA浓度稀释到140 pg时,所得的图形较好;当体系中模板浓度稀释到14 pg时,所得的图形较差。最终DNA检测灵敏度为140 pg。应用该引物和探针建立的q PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出大蒜黑腐病菌。【结论】建立了大蒜黑腐病菌Taq Man探针法q PCR检测体系,该检测技术能够从供试的6种病原菌中特异性检测出大蒜黑腐病菌,检测灵敏度可达140 pg。建立的基于gpd基因的大蒜黑腐病菌q PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,适合口岸大蒜黑腐病菌的快速检测。

埃里砖格孢属真菌的研究进展及展望

埃里砖格孢属设立于1971年,由于具有重要经济价值的菌种不多,而研究较少。但随着一些重要病原菌和内生真菌在该属中的相继发现,近年来越来越多地受到重视。为便于今后开展相关研究,本研究就其形态学、生物学、生理学、生态学及经济意义等方面的研究进展进行了综述,并对将来可能进行的研究进行了展望。埃里砖格孢属真菌的形态特征与蠕形菌类(长蠕孢属、弯孢菌属、凹脐蠕孢属等)和暗色丝分砖格孢子类真菌(匍柄霉属、密格孢属、假格孢属、顶格孢属、链格孢属和单格孢属等)具有很多相似之处,但分生孢子具有宽而厚的隔膜是其最主要的鉴定依据。目前报道23个种,分布在各式各样的生境下,其中21个种分布在13个科的植物根际、根部或茎叶上,我国有5个种。本属中具有重要经济意义的种有2类,一类为植物病原菌,影响大蒜、风信子等作物产量和品质,或引起沙打旺草地早衰;另一类为疯草内生真菌,增加疯草(Astragalusspp.,Oxytropisspp.)毒性,导致家畜中毒。疯草内生真菌可产生的具有重要医用价值的苦马豆素。分子生物学技术已证明埃里砖格孢具有多态性,与匍柄霉亲缘关系比与假格孢属、链格孢和单格孢的亲缘关系远。控制疯草内生真菌的毒害是畜牧业生产中亟待解决的问题。埃里砖格孢的遗传多样性分析、新种寻找和有性态研究,以及苦马豆素的产生机制等研究将是近期主要的研究方向。

沙打旺黄矮根腐病在我国北方5省区的分布与危害

对5省（区）沙打旺主产区进行了病害调查,除辽宁建平之外,沙打旺黄矮根腐病在甘肃环县、宁夏盐池、陕西横山、内蒙松山和敖汉均有发生,发病率为5.7%～82.6%,病情指数为2.7～53.7。各级严重度的植株在病株中的比例因调查地点而异。与健康植株比较,病株枝条数增加16.7%～63.7%,但单株干重下降8.5%～32.9%。各地的植株密度、牧草产量、平均枝条数和单株干重均存在一定差异,其中在发病率最高的甘肃环县,植株密度、牧草产量分别与发病率和严重度均呈显著负相关（P〈0.01）。对影响发病率的因素进行了分析讨论,提出了防治该病的建议。

5种杀菌剂对沙打旺黄矮根腐病菌的室内毒力测定

沙打旺黄矮根腐病(Embellisia astragali)是我国近年发现的沙打旺(Astragalus adsurgens)上最严重的病害,其病菌生活在植株体内,至今尚无有关其化学防治的研究报道。本研究选择了百菌清、甲霜灵、代森锰锌、甲基硫灵菌和三唑酮5种杀菌剂,采用菌落生长抑制法和孢子萌发抑制法测定了对该病菌的防治效果。供试杀菌剂对沙打旺埃里砖格孢的菌落生长、孢子萌发和菌丝伸长均产生一定影响,在3个指标测定中EC50由小到大的顺序均为百菌清<甲霜灵<代森锰锌<甲基硫灵菌<三唑酮,其中百菌清在菌落生长、孢子萌发和菌丝伸长试验中的EC50分别为0.028、0.03和0.04 g·L-1,而三唑酮的为0.46、0.48和0.21 g·L-1。

中国油菜内生真菌一新记录种—垣孢埃里砖隔孢(英文)

报道了一个中国新记录种—垣孢埃里砖隔孢(EmbellisiachlamydosporaSimmons),该种为从油菜(BrassicanapusL.)中分离到的一种内生真菌。文中对垣孢埃里砖隔孢的形态特征作了描述,并附有形态图。

药用植物提取液对沙打旺黄矮根腐病菌的抑菌活性及对其种子萌发的影响

为给植物源杀菌剂防治沙打旺黄矮根腐病菌(Embellisia astragli)提供理论依据,采用生长速率法和凹玻片法测试15种药用植物以及大蒜(Allium sativum)、变绿马铃薯(Solanum tuberosum)和核桃青皮(Juglans regia)3种植物提取液对沙打旺(Astragalus adsurgens)黄矮根腐病菌的离体抑菌活性的影响,并测定抑制效果最好的植物提取液对沙打旺种子萌发活性的影响。结果表明:防风(Saposhnikovia divaricate)、大蒜、核桃青皮3种植物提取液对沙打旺黄矮根腐病原菌具有显著的抑菌作用(P<0.05),抑菌率均达100%,对病原菌孢子萌发抑制力较强,孢子萌发抑制率均达85%。防风、大蒜、核桃青皮3种植物提取液原液对沙打旺种子萌发具有显著抑制作用(P<0.05),种子的发芽势和发芽率均在50%以下。说明防风、大蒜和核桃青皮的提取液对沙打旺黄矮根腐病田间防治有一定应用前景,但在沙打旺播种时不宜使用其提取液进行药剂拌种。

大蒜蒜头黑腐病病原菌鉴定

在陕西关中大蒜产区发现了一种大蒜新病害——蒜头黑腐病,依据柯赫氏证病律进行了病原菌鉴定。由发病蒜瓣分离到一种国内未报道的病原真菌Embellisiaallii(Campanile)Simmons。该菌在PDA平板上菌落灰黑色,边缘整齐;分生孢子梗屈膝状弯曲,有分枝,孢痕明显;分生孢子单生,暗色,椭圆形或近圆柱形,正直,少数弯曲,呈S形或Y形,有暗褐色横膈4～10个,纵膈或斜膈0～2个。孢子大小(30～56)μm×(10～17)μm,表面光滑或微粗糙。用分离菌接种蒜瓣,引起黑腐症状,与自然发病相同。该菌为中国新记录种。

沙打旺黄矮根腐病菌钙调素基因的克隆

沙打旺埃里砖格孢(Embellisia astragali)引起的黄矮根腐病是造成沙打旺(Astragalus adsurgens)草地退化最严重的病害之一。钙调素是Ca2+介导的信号通路中重要的分子。本研究旨在从沙打旺埃里砖格孢中克隆钙调素编码基因序列。以基因组DNA为模板,采用简并引物CAL-228F和CAL-737R扩增得539bp的同源片段;采用Hi-TAIL PCR分别获得344bp的5′侧翼序列和729bp的3′侧翼序列,拼接获得基因的1 290bp的全长DNA序列;利用全长引物CaMF和CaMR,得到840bp的DNA全长序列和450bp的cDNA全长序列,DNA全长序列中有4个内含子,均具有典型的AT-AG特征,cDNA全长序列翻译出149氨基酸多肽。

棘豆蠕孢菌的固体优化培养研究

研究了不同培养基、不同培养条件对棘豆蠕孢菌菌丝生长的影响,并利用正交试验筛选了棘豆蠕孢菌固体培养的优化培养基,用SPSS软件对正交试验的结果进行了分析。结果表明:最佳培养条件是pH=6.5、20℃,最佳培养基配方为玉米粉15%、酵母粉1.5%、生物素0.12%。

棘豆蠕孢菌液体发酵条件优化

采用液体深层发酵的方法，研究了培养条件对棘豆蠕孢菌（Embellisia oxytropis）菌丝体生长的影响，并采用L9（3^4）正交试验优化液体发酵培养基组成。结果表明，试验范围内棘豆蠕孢菌液体发酵培养的最佳条件为：培养基初始pH6．5、培养温度24℃、装液量32％、接种量12％，在此条件下100mL发酵液的菌丝体产量为0．573g；优化培养基配方为：玉米粉5％、马铃薯20％、磷酸二氢钾0．1％、硫酸镁0．08％。菌种扩繁次数对液体发酵的影响较大，第3代开始生物量显著下降。

外源H_2O_2对沙打旺抗黄矮根腐病的影响

本研究以沙打旺抗病和感病品种为材料,接种埃里砖格孢孢子悬浮液后分别施加外源H2O2及其清除剂AsA,通过统计发病率、病情指数及测定POD、PPO、CAT、SOD、Glu和Cht六种病程相关蛋白酶活性,研究H2O2对沙打旺抗黄矮根腐病的影响。结果表明,接种埃里砖格孢后2种沙打旺H2O2含量高于未接种植株,且感病品种在38hH2O2含量最高,为929μmol/g,抗病品种最高值出现在24h,为986μmol/g。抗病、感病沙打旺发病率、病情指数在H2O2处理后最低,施加AsA最高。H2O2处理各种酶活性都有不同程度的增加,且对抗病品种酶活性提高大于感病品种,表明外施H2O2可以减缓沙打旺黄矮根腐病的发生和侵染。表明H2O2与沙打旺抗病性紧密相关,并通过调节病程相关酶活性来增强沙打旺对黄矮根腐病的抗性,减少侵染率。

NO和H_2O_2在沙打旺抗黄矮根腐病反应中的互作

本研究以沙打旺(Astrgalus adsurgens)感病品种宁夏彭阳为试验材料,接种沙打旺埃里砖格孢(Embellisia astragali)后分别施加外源NO及H2O2清除剂抗坏血酸,测定H2O2含量和H2O2代谢酶SOD、POD和CAT活性,以此来探讨H2O2在由NO诱导的防御反应中发挥的作用。与对照相比,外源NO显著降低(P<0.05)沙打旺发病率和病情指数,在开始阶段,外源NO可以诱导内源H2O2产生,在后期,当H2O2浓度相对较高,外源NO会延迟H2O2积累,但用NO和H2O2清除剂同时处理H2O2含量与对照并无显著差异(P>0.05)。NO处理能够诱导SOD、POD和CAT活性增加,H2O2清除剂抑制了NO对3种酶的调控作用。施加外源NO能增强沙打旺抗病性,NO通过调控内源H2O2含量发挥作用。