小鼠胚胎腭突间充质细胞的分离与体外培养方法研究

目的改进小鼠胚胎腭突取材方法,原代培养C57BL/6J小鼠胚胎腭突间充质细胞并加以纯化。方法通过改良方法在显微镜下切取胚胎腭突,然后应用DISPASE酶消化离体腭突,纯化腭突胚胎间充质细胞,免疫荧光染色法鉴定腭突间充质细胞生物学特性。结果改良的取材方法使小鼠胚胎腭突取材更精确,操作更简单;纯化后的原代间充质细胞几乎不含上皮细胞;免疫荧光显示细胞HNK-1、S-100、波形蛋白标记阳性,角蛋白标记阴性。结论建立了一种小鼠胚胎腭突精确取材及纯化腭突外胚间充质细胞的方法,为下一步研究工作打下基础。

原代培养小鼠胚胎腭突间充质细胞的纯化方法研究

目的:建立纯化原代培养的小鼠胚胎腭突间充质细胞的纯化方法。方法:应用D ispase酶4℃消化处理离体小鼠胚胎腭突18 h,通过振荡法使上皮和间充质分离,吸去上皮片。结果:应用流式细胞仪检测,胚胎腭突间充质细胞内几乎不含上皮细胞。结论:本方法为体外研究提供了理想的模型。

地塞米松对小鼠腭突细胞增殖和分布的影响

目的:通过比较不同时期正常胎鼠和地塞米松诱导的腭裂胎鼠中间嵴上皮细胞(MEE)和腭突间充质细胞(EPM)的数目和分布情况,初步探讨腭裂形成的机制。方法:选取孕鼠30只,随机分为对照组和实验组,实验组于妊娠GD11.5腹腔内注射50mg/kg地塞米松,干扰胎鼠腭突发育,分别于GD12.5,13.5,14.5,15.5,16.5时取材,共获胚胎284只,取头部标本做冠状切片,切片厚6μm,HE染色,光镜下观察,记录MEE细胞的数量和EPM细胞的数目和分布情况。结果:实验组和对照组腭突突部EPM明显多于根部,且实验组EPM发育滞后于对照组;GD13.5,14.5,15.5时实验组EPM细胞数量少于对照组;实验组MEE细胞在GD15.5,16.5时大量存在,而对照组GD14.5时开始融合甚至消失。结论:地塞米松导致的EPM细胞增殖抑制和MEE细胞的转归异常,是腭裂形成的重要原因。

小干扰RNA抑制胚胎腭突间充质细胞7-脱氢胆固醇还原酶基因的表达

目的观察小鼠胚胎腭突间充质（EPM）细胞中7-脱氢胆固醇还原酶基因（Dhcr7）的表达，筛选出针对EPM细胞Dhcr7的最有效小干扰RNA（siRNA）序列。观察RNA干扰（RNAi）沉默Dhcr7的表达后，对EPM细胞增殖的影响。方法化学合成3条针对Dhcr7mRNA的siRNA，阳性脂质体介导转染EPM细胞。荧光显微镜观察转染效率，Westernblot法检测Dhcr7蛋白表达变化，噻唑蓝（MTT）检测沉默后增殖率的变化。结果siRNA转染效率为72．6％。3条siRNA对EPM细胞Dhcr7基因表达都有抑制作用，siRNA-3抑制作用最明显，达60．2％，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）。Dhcr7沉默后EPM细胞增殖抑制率为56．4％，与阴性对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论筛选出针对EPM细胞Dhcr7最有效的siRNA序列。siRNA可抑制EPM细胞Dhcr7基因表达，Dhcr7表达降低可抑制EPM细胞增殖。

小鼠胚胎腭突间充质细胞体外培养及生物学特性研究

目的 研究小鼠胚胎腭突间充质 (EPM)细胞的生物学特性。方法 在显微镜下解剖妊娠第 13天的母鼠胚胎腭突 ,用 0 .2 5 %胰蛋白酶进行消化获得游离分散的EPM细胞 ,在含 10 %胎牛血清的DMEM培养基中进行培养。采用免疫组化方法进行细胞鉴定 ,通过相差显微镜 ,生长曲线及透射显微镜观察细胞形态 ,增殖能力及超微结构。结果 EPM细胞为成纤维细胞样细胞 ,排列无序 ,细胞核大 ,核分裂象多 ,核膜内陷 ,核呈分叶状 ,胞浆含大量线粒体及粗面内质网。免疫组化显示角蛋白标记为阴性 ,S -10 0蛋白及波形蛋白标记为阳性。EPM细胞呈指数生长 ,有较强的增殖能力。结论 EPM细胞体外培养生长及增殖良好 ,可作为腭裂基础研究较理想的研究对象。