Rictor对小鼠胚胎干细胞来源心肌细胞线粒体钙信号的调控

目的:探索Rictor在小鼠胚胎干细胞来源心肌细胞(ESC-CM)中的表达、定位及其对线粒体钙信号的调控作用。方法:通过经典“悬滴一悬浮一贴壁”三步法建立ESC-CM模型。利用免疫荧光法及蛋白质印迹法观察Rictor在ESC-CM中的定位。慢病毒技术干扰小鼠胚胎干细胞Rictor表达后,采用免疫荧光法考察ESC-CM内质网与线粒体的叠加情况;通过透射电镜观察ESC-CM的超微结构;活细胞工作站测定分化后心肌细胞线粒体钙瞬变;免疫共沉淀法检测ESC-CM中1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R)、葡萄糖调节蛋白75(Grp75)、线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)间的相互作用;蛋白质印迹法检测线粒体融合蛋白2(Mfn2)的表达情况。结果:Rictor在ESC-CM中主要定位于内质网及线粒体一内质网结构偶联(MAM)域,且其表达定位与线粒体及内质网有很好的叠加。干扰Rictor后,心肌细胞线粒体部分呈散点状,线粒体与内质网的叠加率降低(P<0.01);ESC-CM超微MAM形成减少;ATP刺激引起的ESC-CM线粒体钙瞬变幅度下降,其中钙瞬变斜率和上升峰值均降低(均P<0.01);MAM中IP3R、GTp75、VDAC1相互作用明显减弱,且Mfn2蛋白表达降低(P<0.01)。结论:干扰小鼠胚胎干细胞中Rictor表达可降低ESC-CM中钙从内质网到线粒体的释放,这可能是通过影响IP3R、Grp75、VDAC1间相互作用,减少Mfn2表达,进而破坏MAM来实现的。

2种饲养层对牛iPSCs从始发态向初始态转化的影响

饲养层细胞对获得多能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)非常重要,小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)已被广泛用作培养和产生多种胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)及诱导PSCs(induced PSCs,iPSCs)的饲养层,但由于种间差异,MEF可能不适于家畜ESCs和iPSCs。研究表明,PSCs可被分为至少2种多能性状态:初始态(naive state)和始发态(primed state)。本室前期用MEF饲养层从牛睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)获得了牛的始发态iPSCs。本研究基于初始态培养液(na6ve medium,NM),比较了MEF饲养层和牛胚胎成纤维细胞(bovine embryonic fibroblasts,BEF)饲养层对牛iPSCs多能性和形态维持及其从始发态向初始态样转化的影响。结果显示,MEF+NM(MNM)和BEF+NM(BNM)均能在3~4 d内将牛iPSCs从始发态转化为初始样状态。克隆分析显示,BNM培养中牛iPSCs的克隆数、碱性磷酸酶活性和转化效率均高于MNM培养中的指标。这些克隆在长期培养中均能表达初始态iPSCs的多能性分子标记。结果表明,采用NM条件,在MEF和BEF饲养层上均可产生牛初始态样iPSCs,但在BEF上转化效率较高。