重庆地区人类免疫缺陷病毒携带者的微孢子虫感染情况调查

目前我国关于微孢子虫感染人的研究相对较少,更没有关于重庆地区人类免疫缺陷病毒(HIV)携带者感染微孢子虫的数据统计。对重庆市公共卫生医疗救治中心收治的22例HIV抗体阳性,但尚未接受抗病毒治疗的患者进行研究。将22例患者粪便样本分别提取总DNA,通过聚合酶链反应(PCR)法和DNA测序等技术对微孢子虫在患者中的感染情况进行检测,并对微孢子虫种类进行鉴定。同时对22例患者的免疫细胞亚群进行计数和分析。结果显示,微孢子虫的感染率为36.3%(8/22),主要由脑炎微孢子虫属(Encephalitozoon spp)的海伦脑炎微孢子虫(E.hellem)和肠脑炎微孢子虫(E.intestinalis)引起。22例患者的免疫细胞亚群分析显示,平均淋巴细胞数0.93±0.13×10^9/L,CD4^+T细胞数132±22个/mL,CD8^+T细胞数495±91个/mL,CD4/CD8细胞比值0.37±0.1,表明患者免疫功能受到严重抑制。进一步将微孢子虫感染患者与未感染患者的免疫细胞亚群进行比较发现,感染患者淋巴细胞数为0.51±0.1×10^9/L,未感染患者为1.17±0.17×10^9/L,两者具有显著差异(P<0.05);感染患者CD4^+T细胞数为71±27个/mL,未感染患者为167±28个/mL,两者具有显著差异(P<0.05);感染患者CD8^+T细胞数为209±35个/mL,未感染患者为658±123个/mL,两者具有显著差异(P<0.05),以上表明微孢子虫感染组的免疫功能受损情况更严重。本研究结果提示微孢子虫的机会性感染与患者免疫功能受损情况密切相关,脑炎微孢子虫属在重庆地区有较高的感染率,这为进一步阐明微孢子虫与宿主相互作用关系奠定基础,也为公共卫生健康管理提供重要参考。

大观霉素磺酰化衍生物的合成及抗微生物活性研究

微孢子虫是一类威胁畜牧渔生产与人类健康的胞内寄生真核微生物,但目前尚无专用微孢子虫化学治疗药物。基于大观霉素的低毒性和磺酰胺的良好药学性质,作者设计了大观霉素的磺酰胺类衍生物;通过反应条件探索,以52%~74%的收率合成了21个目标分子,并通过氢谱、碳谱、高分辨质谱等确证了分子结构;通过体外筛选,研究了目标分子的宿主细胞毒性和对脊椎动物微孢子虫代表-海伦脑炎微孢子虫的生物活性,发现各有4个目标分子能抑制或促进海伦脑炎微孢子虫增殖。本研究建立了大观霉素的磺酰胺类衍生物的合成方法,发现了对海伦脑炎微孢子虫有效的新型化合物,为大观霉素的进一步衍生及微孢子虫治疗药物的发现提供了新的思路。

海伦脑炎微孢子虫分泌蛋白EhPTP4对宿主内质网蛋白降解通路的调控作用

【目的】微孢子虫是一类专性细胞内寄生的真核病原微生物,能够感染人类和几乎所有的动物。本课题以海伦脑炎微孢子虫(Encephalitozoon hellem)为研究对象,探讨其极管蛋白4(EhPTP4)作为一个潜在的分泌性毒力因子在宿主细胞内的定位和功能。【方法】制备EhPTP4的鼠源多克隆抗体,利用间接免疫荧光分析和Western blotting确定EhPTP4在感染细胞中的亚细胞定位;基于序列特征,在HEK293细胞中转染野生型和突变体EhPTP4,分析该蛋白的定位及其对病原增殖的作用;利用RNA-seq对转染EhPTP4的HEK293细胞进行转录组测序,分析EhPTP4引起的宿主基因表达和通路的变化;进一步通过RNAi和细胞转染分析差异表达基因的调控作用,利用RT-qPCR和Western blotting验证调控效果。【结果】EhPTP4的N端具有信号肽,C端具有富含组氨酸的结构域(HRD)和核定位信号序列(NLS)。蛋白定位分析显示,在感染和转染细胞中,EhPTP4均被分泌至宿主细胞核内。在HEK293细胞中过表达EhPTP4显著促进了病原的增殖。RNA-seq和蛋白泛素化分析发现,EhPTP4显著上调了宿主内质网蛋白降解通路(endoplasmic reticulum-associated degradation,ERAD)关键基因(PDIA4、HERP、HSPA5和Derlin3)的表达和宿主蛋白的泛素化修饰,表明EhPTP4具有调控宿主内质网蛋白降解的功能。在HEK293细胞中过表达PDIA4发现,蛋白泛素化修饰明显上调,而RNA干扰PDIA4则导致HERP基因表达下调,表明PDIA4在病原调控宿主ERAD过程中发挥着关键作用。进而,对EhPTP4的HRD进行了缺失突变(EhPTP4ΔHRD)并转染细胞,发现此缺失突变体并未引起PDIA4和HERP的表达发生显著上调,表明HRD对EhPTP4的毒力功能起到关键作用。【结论】首次报道了微孢子虫利用分泌蛋白调控宿主的ERAD和蛋白泛素化,为深入解析该病原的致病机理提供了重要参考。