内质网膜蛋白复合物亚单位6调控细胞增殖和凋亡对宫颈癌Hela细胞放射线敏感性的影响

目的探讨内质网膜蛋白复合物亚单位6(EMC6)调控细胞增殖和凋亡对宫颈癌Hela细胞放射线敏感性的影响。方法将宫颈癌Hela细胞分为CON组(正常宫颈癌Hela细胞)、shCtrl组(EMC6基因空白质粒转染宫颈癌Hela细胞)和shEMC6组(EMC6基因短发夹RNA干扰表达质粒转染宫颈癌Hela细胞),给予2、4、6、8 Gy X线外照射处理,照射处理后采用定量聚合酶链反应法检测EMC6 mRNA表达水平,蛋白质印迹法检测EMC6蛋白表达水平,克隆形成实验检测细胞增殖水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平和细胞周期。结果shEMC6组EMC6 mRNA表达水平低于shCtrl组[(0.530±0.017)比(1.004±0.108)](P=0.002),EMC6的敲减率为47.24%。shEMC6组EMC6蛋白表达水平低于shCtrl组[(0.506±0.012)比(0.528±0.005)](P=0.023)。2、4 Gy X线照射处理后,shEMC6组细胞增殖水平均低于shCtrl组和CON组(均P<0.05)。2 Gy X线照射后4、8、12 h,shEMC6组细胞凋亡率均高于shCtrl组[(45.71±0.66)%比(34.86±1.16)%、(13.85±0.24)%比(12.85±0.19)%、(22.74±0.14)%比(17.77±0.40)%],差异均有统计学意义(均P<0.05)。2 Gy X线照射前0 h,shEMC6组S期细胞比例低于shCtrl组,G_(2)期细胞比例高于shCtrl组(均P<0.05);照射后4 h,shEMC6组S期细胞比例低于shCtrl组(P<0.05),G_(2)期细胞比例与shCtrl组比较差异无统计学意义(P>0.05);照射后8 h,shEMC6组S期细胞比例高于shCtrl组,G_(2)期细胞比例低于shCtrl组(均P<0.05);照射后12 h,shEMC6组S期细胞比例与shCtrl组比较差异无统计学意义(P>0.05),G_(2)期细胞比例低于shCtrl组(P<0.05)。结论宫颈癌Hela细胞沉默EMC6后,细胞增殖减少,同时细胞凋亡和G_(2)期细胞数量显著增加,对放射线的敏感性显著提高。

腺病毒介导的EMC6基因通过下调FAK信号通路抑制胃癌细胞迁移

内质网膜蛋白复合物亚单位6(endoplasmic reticulum membrane protein complex subunit 6,EMC6),也称穿膜蛋白93(transmembrane protein 93,TMEM93)是我们首次报道的一个人类自噬相关分子。EMC6基因进化保守,表达广泛,在胃癌组织中表达下调或缺失。本研究利用构建的重组腺病毒5型EMC6(Ad5-EMC6)载体,感染胃癌细胞系BGC823和SGC7901,分析了其在肿瘤细胞的表达以及抗肿瘤活性。研究证明,Ad5-EMC6能够显著抑制胃癌细胞的克隆形成、细胞划痕修复、以及迁移和侵袭的能力。进一步的研究提示,Ad5-EMC6能够降低胃癌细胞局部黏着斑激酶(FAK)的Y576/577磷酸化水平,FAK下游的基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的蛋白质水平也同时下调。在裸鼠的腹膜扩散模型中,Ad5-EMC6处理组的小鼠腹膜结节数量明显减少或缺失。这些研究数据提示,Ad5-EMC6介导的FAK信号灭活可能是其抑瘤活性的机制之一,其分子机制还需要进一步探讨。

含EMC6基因重组真核表达载体的构建及其在人肝L-02细胞中的异位表达

目的:构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,并将其在人肝L-02细胞株中过表达。方法:查询Pub Med上EMC6的基因序列,针对该序列设计引物,提取L-02细胞的总RNA、聚合酶链式反应(PCR)扩增目的片段,采用基因重组技术将EMC6的cDNA定向插入真核表达载体pcDNA3.1中,构建pcDNA3.1(+)/EMC6真核表达载体,经菌落PCR,测序验证构建的准确性。应用脂质体转染方法将重组载体转入L-02细胞中,RT-PCR、蛋白质印迹法检测EMC6基因的mRNA和蛋白表达水平。结果:PCR和基因测序结果均表明pcDNA3.1(+)/EMC6重组质粒构建成功,RT-PCR和蛋白质印迹检测结果证实EMC6在人肝L-02细胞中过表达。结论:成功构建人pcDNA3.1(+)/EMC6重组质粒,并在L-02细胞中过表达。

内质网膜蛋白复合物10(EMC10)的研究进展

内质网膜蛋白复合物10(endoplasmic reticulum membrane protein complex subunit 10,EMC10)属于内质网膜蛋白复合物(endoplasmic reticulum membrane protein complex,EMC)家族,具有进化上的高度保守性。EMC10具有分泌型蛋白质和膜型蛋白质两种同源异构体,与糖代谢、肿瘤生长、神经系统疾病、心血管疾病、雄性不育等方面有关。本文就EMC10的基因和功能进行综述,为进一步研究EMC10在生命活动中的作用机制提供理论基础。

内质膜蛋白复合体亚基6对海拉细胞自噬的调控作用

目的 探讨内质膜蛋白复合体亚基6（EMC6）基因在海拉（HeLa）细胞中的自噬调解活动。 方法 （1）构建3种质粒：EMC6真核表达质粒、特异性干扰EMC6质粒、空白质粒。分别将3种质粒转染HeLa细胞，筛选3组中的稳定表达细胞株。（2）用实时定量聚合酶链反应（Real-time PCR）、Western blot检测3组质粒转染后Hela细胞中EMC6 mRNA表达结果。（3）电镜下观察HeLa细胞内自噬体；用自噬抑制剂Bafilomycin A1和3-甲基腺嘌呤（3-MA）分别作用于转染EMC6质粒的处理组、空白质粒组和HeLa组，在共焦显微镜下观察比较细胞株中绿色荧光蛋白（GFP）-微管相关蛋白1轻链3（LC3）的变化。 结果 （1）Real-time PCR法检测转染不同质粒进入HeLa细胞株后，处理组、干扰组及空白质粒组各5例，2－ΔΔCt的平均值分别为3.29±0.62、0.38±0.04、1.11±0.20，EMC6 mRNA拷贝数量在3组之间差异有统计学意义（P＝0.020）。（2）在转染了EMC6质粒的HeLa细胞组中可观察到自噬体形成，并观察到Bafilomycin A1作用于3组细胞后，可见GFP-LC3斑点聚集，而EMC6过表达组的LC3斑点明显较空白质粒组及HeLa组丰富。 结论 过表达EMC6蛋白可使HeLa细胞内自噬体数目增加，可能使宫颈癌细胞内自噬活动增强；EMC6过表达细胞株中，磷酸肌醇3激酶（PI3K）抑制剂抑制了EMC6所诱发的自噬过程。

内质网-细胞膜连接对细胞内钙稳态的影响及其在心血管疾病中的意义

钙超载是心血管疾病发生的重要机制之一。内质网(endoplasmic reticulum,ER)是调控细胞内钙、维持钙稳态的重要细胞器,它通过钙摄取、钙存储以及钙转运这三种方式对细胞内钙进行调控,其中,ER相关的钙转运是钙信号传递的中心环节。ER通过其特殊的结构广泛分布于细胞内,其膜上具有众多的连接位点,新近的研究报道这些连接位点可与细胞膜(plasma membrane,PM)和细胞器膜(例如线粒体、溶酶体、高尔基体等)形成连接,进而实现钙离子的转运。本文对内质网-细胞膜连接(endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions,ER-PM连接)及相关心血管疾病病理、生理学过程的研究进展作一综述,为防治心血管疾病提供理论依据。

人类甾类激素加工酶CYP7B1的纯化制备与互作网络

细胞色素P450单加氧酶CYP7B1是位于内质网上的跨膜蛋白,其重要功能是催化胆固醇骨架7位的羟化反应,产生多种重要甾类分子,包括7α羟基-脱氢表雄酮和7α羟基孕烯醇酮等.CYP7B1基因突变造成的功能异常可引起多种疾病,如遗传性痉挛性截瘫和先天性胆汁酸合成障碍等.为了解人类CYP7B1蛋白的结构与功能,我们对其进行了重组表达与纯化,发现其在去垢剂DDM、DM、NM、OM中均能稳定存在并结合有氧化还原辅因子铁卟啉.利用纯化CYP7B1进行的亲和介质拉取-质谱分析发现,CYP7B1可以与另一种还原酶CYPOR发生相互作用,随后的体外互作分析证实了这一发现.在此基础上,通过重组共表达体系和体外组装方式的筛选实现了CYP7B1-CYPOR蛋白质复合物的纯化制备.本研究成功地进行了跨膜单加氧酶CYP7B1的纯化,并且发现内质网可能存在一个涉及CYP7B1和其他氧化还原酶的催化复合物,还进一步实现了CYP7B1-CYPOR复合物的纯化制备.