EGFP和LmxlA双基因共表达重组腺病毒的构建及检测

目的:通过携带绿色荧光蛋白(EGFP)和转录因子Lmx1A(LIM homeobox transcription factor1-alpha)的双顺反子重组腺病毒的构建和包装,评价双顺反子构建方法的可行性,为进一步探讨转录因子Lmx1A在间充质干细胞分化为神经元细胞的潜能提供实验基础。方法:通过PCR方法获得增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和转录因子Lmx1A的CDS区序列,将其构建到双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA,通过PCR的方法获得双顺反子表达盒,并插入到腺病毒穿梭质粒pShuttleCMV中,经过与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的同源重组,获得阳性重组质粒pAd-EGFP-Lmx1A,并进一步在HEK293细胞中包装为腺病毒。用携带EGFP和Lmx1A基因的重组腺病毒感染人脐带间充质干细(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUC-MSCs),通过RT-PCR、免疫荧光及Western blot的方法检测EGFP和Lmx1A的表达及产物定位。结果:透射电镜检查包装好的重组腺病毒为典型的腺病毒颗粒形态,大小约为75nm。Ad-EGFP-Lmx1A感染hUC-MSCs后检测到EGFP和Lmx1A的转录产物,表达产物互不影响,表达强弱无明显差异。结论:利用双顺反子真核表达质粒pcDNA3.0BA能够构建同时表达两个基因的重组腺病毒,腺病毒感染细胞后能够将两个基因传递至间充质干细胞中并表达。通过EGFP的观察可对腺病毒的表达效率进行实时观察,这些研究结果为任意组合的双基因表达建立了快速有效的构建方法,重组腺病毒Ad-EGFPLmx1A的成功构建也为将来研究Lmx1A在间充质干细胞分化为神经元过程中的作用提供了实验基础。