抗Her-2-scFv-SEC2融合免疫毒素的构建和功能研究(英文)

用基因工程方法,将金黄色葡萄球菌肠毒素 C2 与抗人表皮生长因子受体 HER-2 单链抗体 scFv-B1,以一连接短肽连接,构建融合免疫毒素 B-L-SEC2,并用改进的新型表达载体 pASK75-EX,在大肠杆菌 BL21(ED3)中表达. 以不溶性包涵体形式表达的目的蛋白经变性后以镍离子螯和层析纯化,并以透析法进行复性. 流式细胞术和 MTT 实验结果表明,纯化复性的融合免疫毒素 B-L-SEC2,在体外具有与 HER-2 过表达的靶细胞 SK-Br-3 特异性结合的活性,并对该细胞产生显著的特异性生长抑制作用.

SEC2在莱茵衣藻中的表达及免疫学活性分析

通过将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)肠毒素C2(staphylococcal entero-toxin C2,SEC2)基因进行定点突变,获得具有超抗原性的减毒C2基因序列sec2t,把该基因插入含Hsp 70A-RBCS2启动子和RBCS2终止子的pH124载体上,构建莱茵衣藻表达载体pH124sec2t,采用'珠磨法'将该载体转入细胞壁缺陷型莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC-849中,经含10μg/mL Zeomy-cin的抗性平板筛选、PCR及RT-PCR分析,获得转基因莱茵衣藻Tran-sec2t.Southern blot和Western blot分析表明,sec2t基因已整合入莱茵衣藻核基因组中,且能表达相对分子质量为26 kDa(1 Da=1 u)的目的蛋白.分别以CC-849和Tran-sec2t两种藻细胞培养液(每毫升106个细胞)喂食Balb/c小鼠,并用流式细胞仪检测分析小鼠CD3+、CD4+和CD8+细胞,结果发现,可表达减毒超抗原SEC2T的转基因莱茵衣藻Tran-sec2t能刺激小鼠T淋巴细胞的产生;与对照相比,CD4+与CD8+细胞数目比值有所降低,但CD3+和CD8+细胞有明显提高.研究结果有助于利用转基因藻生产抗肿瘤制剂和动物免疫增强剂.

金葡菌肠毒素SEC2的抗体制备及应用

生产厂家以金葡菌肠毒素C2(SEC2)的标示量作为金葡素注射液的质量控制标准,但其真正的含量由于滤液成分复杂而很难检测,本实验试图建立一种方便的鉴定金葡素注射液中的SEC2的方法。首先将重组的SEC2分别免疫BALB/c小鼠和新西兰兔,制备并纯化了单克隆及多克隆抗体。采用自制的抗体建立了检测SEC2的生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附实验,检测目标蛋白的质量浓度范围为2～20ng.mL-1,在检测范围内检测值的平均变异系数为5.08%,采用本法检测质量浓度分别为100ng.mL-1的重组肠毒素(SEA/SEO/SEM/SEN/SEG/SEI),均呈现阴性反应,说明此检测方法的专一性较好。采用此方法对金葡素注射液中的SEC2含量进行了检测,发现SEC2标识量与实际含量存在一定的差距。

金葡菌肠毒素C2的单克隆抗体制备、鉴定及初步应用

目的：制备抗金葡菌肠毒素C2（SEC2）的单克隆抗体（MeAb），并建立SEC2检测方法。方法：以金葡菌培养液中纯化的SEC2为抗原，免疫BALB／c小鼠，制备单克隆抗体；并对单克隆抗体的特性进行鉴定；利用纯化后的抗体建立了夹心ELISA定量检测SEC2方法，并进行了验证和初步应用。结果：筛选出4株稳定分泌抗SEC2抗体的杂交瘤细胞株，其免疫球蛋白亚类均为IgG1，除两株单抗的SEC2识别位点相同外，其余单抗均特异性识别SEC2的不同结合位点。建立的夹心ELISA定量检测法，特异性、灵敏度、重复性均较好，检测SEC2范围为0．5—20ng,／ml，回收率在97．8％-101％，变异系数为2％-5％。结论：本研究制备的抗SEC2的单克隆抗体，可用于建立了SEC2定量检测方法，为控制金葡素制品质量和金葡菌肠毒素研究提供了较实用的方法。

肠毒素C2第20和22位氨基酸对其超抗原活性的影响

目的:揭示突变蛋白SEC2(T20L/G22E)超抗原活性较野生型SEC2显著增强的潜在机制。方法:WST-1法检测突变蛋白SEC2(T20L/G22E)在体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性,进一步应用流式细胞术和荧光定量PCR技术分别检测CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖、特异性VβT淋巴细胞增殖以及相关细胞因子mRNA丰度变化。结果:与野生型SEC2相比,突变蛋白SEC2(T20L/G22E)能够在体外显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,但二者具有相似的特异性VβT淋巴细胞增殖谱,并且SEC2(T20L/G22E)能够较rSEC2激活更多携带有Vβ5.3、Vβ8.1及Vβ8.3的T淋巴细胞;进一步体内实验发现SEC2(T20L/G22E)能够较rSEC2激活更多外周血和脾脏中CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖及相关细胞因子的表达。结论:突变蛋白SEC2(T20L/G22E)超抗原活性增强的机制可能是用亮氨酸和谷氨酸替代原来20和22位上的氨基酸后提高了SEC2(T20L/G22E)与特异性TCR-Vβ的亲和力,进一步激活更多的SEC2特异性T淋巴细胞,最终引起T淋巴细胞亚型的显著性增殖,同时诱导更多与抗肿瘤、增殖相关的细胞因子的表达。

葡萄球菌肠毒素C2突变体的构建及其体外抗肿瘤活性分析

目的：利用基因定点突变的方法将葡萄球菌肠毒素C2（SEC2）的31位定点突变,以获得抑瘤效果增强的肠毒素。方法：利用基因定点突变的方法,将SEC2中31位的His用Asn替代,转入大肠杆菌中诱导表达,采用CM弱阳离子层析柱纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western印迹对其进行鉴定,通过MTS法检测其体外抗肿瘤活性。结果：构建了突变体蛋白SEC2（H31N）,并在大肠杆菌中实现了高效表达。体外实验表明,在相同浓度下,SEC2（H31N）对多种肿瘤细胞的抑制作用明显优于野生型SEC2,尤其在低浓度下此现象更为明显。对于5个受试细胞株,SEC2（H31N）的IC50均低于SEC2;SEC2（H31N）浓度分别为0.01~10、0.01和0.1 ng/mL时,对肿瘤细胞SMMC-7721、HepG2、A549的生长抑制率与SEC2相比均显著提高。结论：同野生型SEC2相比,突变体蛋白SEC2（H31N）对肿瘤生长的抑制作用得到了提高。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因定点突变分析

目的利用金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因His118定点突变,以获得超抗原性保持不变的减毒肠毒素。方法利用PCR介导的定点突变技术,对SEc2基因中的His118密码子进行定点突变,得到的带有突变基因的表达质粒在大肠埃希菌中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达。采用镍离子金属整合(Ni-NTA)亲和层析和凝胶过滤层析纯化突变体蛋白,并测定突变体蛋白超抗原性及体外抑瘤效果。结果应用点突变试剂盒,PCR扩增得到SEc2突变体表达质粒pET-28a-SEC2(H118Y)在1mmol/LIPTG诱导下高效表达。突变体蛋白SEC(H118Y)在2～200 ng时刺激人体细胞增殖效果与SEC2基本一致,体现二者具有相同的超抗原性。SEC(H118Y)时,在2～200 ng与SEC2抑制大肠癌细胞Cx-1效果基本相同,而在500 ng时,SEC(H118Y)抑瘤效果明显优于与SEC2。结论SEC(H118Y)超抗原性和抑瘤活性没有因His118位点的突变而改变。

豚鼠和BALB/c小鼠对SEC2超抗原作用敏感性的比较

比较分析豚鼠和BALB/c小鼠对金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcus enterotoxin C2,SEC2)超抗原作用的敏感性差异,确定更适合用于SEC2超抗原作用研究的模式动物。体外试验,以梯度浓度SEC2刺激豚鼠和BALB/c小鼠的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)和脾淋巴细胞,MTS染色法检测其增殖;体内实验,SEC2腹腔注射豚鼠和BALB/c小鼠,每隔3 d检测豚鼠和小鼠的体重、体温变化情况;每隔7 d采血,ELISA法检测血清中IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α分泌水平。不同浓度的SEC2均能刺激小鼠的PBMC和脾淋巴细胞显著增殖(P<0.05),而对豚鼠的PBMC和脾淋巴细胞无效。腹腔注射后,SEC2组和对照组豚鼠和小鼠的体温均无显著性变化(P>0.05);豚鼠SEC2组体重在给药后期显著低于对照组(P<0.05),小鼠的SEC2组体重在给药后第3-30天均显著低于对照组(P<0.05),此后恢复到正常水平(P>0.05);给药后各时间点,小鼠的SEC2组血清中细胞因子IL-4、IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌水平均显著高于对照组(P<0.05),而豚鼠的SEC2组血清中细胞因子分泌水平与对照组无显著性差异(P>0.05)。与豚鼠相比,BALB/c小鼠对SEC2超抗原活性的敏感程度更高,且表现出很好的剂量和时间效应,适合作为模式动物用于SEC2的超抗原活性研究。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2的纯化与活性研究

目的:研究金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)的活性与病情的关系,进一步探索其在金黄色葡萄球菌感染中的作用机制。方法:选取2021年1月—2022年12月东莞市滨海湾中心医院收治的肠道感染患者30例作为研究对象。使用传统的培养方法从粪便样本中分离出金黄色葡萄球菌。使用离心技术获得细菌培养物,进一步纯化金黄色葡萄球菌SEC2。结果:金黄色葡萄球菌SEC2在经过一系列纯化步骤后,获得了高纯度的样品。从发酵液到超滤浓缩再到硫酸铵盐析、离子交换以及分子筛层析的过程中,目的蛋白质的含量逐渐减少,但蛋白质的纯度逐步提高。结论:金黄色葡萄球菌SEC2是金黄色葡萄球菌感染中的病原因子。通过成功纯化高纯度的SEC2样品,证实其具有明确的质量和结构特征,进一步证实了SEC2在金黄色葡萄球菌感染中的重要性。

一种快速分离纯化金葡萄球菌肠毒素C_2的方法

目的建立一种简单快捷的方法,用来从金黄色葡萄球菌的发酵液(以下简称金葡液)中纯化分离肠毒素C2(staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)。方法金葡液首先经超滤浓缩,之后再分别经阳离子交换层析和阴离子交换层析进行选择性分离SEC2,用SDS-PAGE电泳、HPLC法检测纯度及相对分子质量,飞行质谱测定精确分子质量,对其进行N-端氨基酸序列分析。结果分离得到的SEC2电泳纯及色谱分析纯度均达到质量分数98%以上,经各项理化指标检测均与文献一致,在等电点上表现出微不均匀性,等电点pI为7.49和6.74,该蛋白的分子质量为27.58 ku,N-端氨基酸序列分析与文献报道的SEC2序列一致(ESQPDPTPDELHKSS),最大吸收波长为277.5 nm。结论用该方法得到的SEC2纯度高,回收率质量分数高达50%,适宜于大批量制备SEC2。

金黄色葡萄球菌肠毒素C_2对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的实验研究

目的观察不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)对体外兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的诱导分化作用。方法以梯度密度离心法获得rBMSCs并通过激光共聚焦对细胞进行形态学鉴定后传代培养,分别应用1、10、100、500μM SEC2处理细胞,检测各组细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的增殖情况;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测骨桥蛋白和胶原蛋白的基因表达。结果 rBMSCs在应用SEC2诱导时,随着浓度的增加,rBMSCs的增殖逐渐被抑制,其中100μM SEC2共培养细胞增殖情况明显高于对照组(P<0.01);应用100μM SEC2诱导rBMSCs 16d后,成骨诱导检测茜素红染色可见矿化和钙沉积;同时进行RT-PCR检测,随着培养时间的延长,骨桥蛋白(Osteopontin)和胶原蛋白-1(Collagen I)有明显上调趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 SEC2能够使rBMSCs成骨分化,分化的效果与肠毒素剂量及诱导时间相关。

增强型金黄色葡萄球菌肠毒素C2突变体及其超抗原活性

金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)作为一种超级抗原蛋白,极微量即可有效激活机体免疫系统,这一特性可应用于对肿瘤和感染性疾病的辅助治疗。为了增强SEC2的超抗原活性,应用over-lap PCR方法将SEC2中的102～106位GKVTG氨基酸残基分别突变为WWH、WWT和WWP,获得3种突变体ST-1、ST-2和ST-3。三种突变体刺激小鼠淋巴细胞增殖活性和肿瘤细胞生长抑制活性与野生型SEC2相比均有显著提高。ST-1和ST-3的致热活性与野生型SEC2相当,而ST-2的致热活性明显高于野生型SEC2。此外,三种突变体体外刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平也显著提高,这可能是导致突变体具有较高肿瘤细胞生长抑制活性的原因。进一步实验发现,三种突变体刺激下,小鼠脾淋巴细胞mVβ8.2基因的转录水平较野生型SEC2显著增加,暗示突变体对TCR mVβ8.2分子亲和力的提高,可能是其超抗原活性增强的主要原因。

活性增强的SEC2截短突变蛋白的构建及其生物活性研究

目的:分析金黄色葡萄球菌肠毒素C2的截短蛋白SEC14-239中7和9位氨基酸对其超抗原和抗肿瘤活性的影响。方法:利用基因工程方法将SEC14-239中7和9位Thr和Gly分别替换为Leu和Glu后,获得截短突变蛋白SEC14-239M。体外细胞学实验对其超抗原活性和抗肿瘤活性进行分析。结果:突变蛋白SEC14-239M体外刺激小鼠T细胞增值活性较SEC14-239显著增强(P<0.05),与未截短的SEC2相当(P>0.05)。在相同剂量条件下,SEC14-239M诱导的抗肿瘤活性尽管低于SEC2(P<0.01),但要显著高于SEC14-239(P<0.05)。结论:截短蛋白SEC14-239的第7和9位氨基酸突变后能显著增强其超抗原活性和抗肿瘤活性,但二者增强程度有差异。这一结果说明以定点突变改造SEC2截短体的活性是可行的,同时也暗示超抗原的T细胞增殖和诱导肿瘤细胞抑制并不完全关联。

Zn^2＋及其谷氨酸结合位点突变对金黄色葡萄球菌肠毒素 C2超抗原活性的影响

目的：研究金黄色葡萄球菌（金葡菌）肠毒素C2（SEC2）中与Zn^2＋结合相关的谷氨酸残基突变及Zn^2＋自身对其超抗原活性的影响。方法应用定点突变技术将SEC2中与Zn^2＋结合相关的谷氨酸残基突变成丙氨酸残基，分离纯化后获得突变蛋白rSEC2（E71A）、rSEC2（E80A）及rSEC2（E71A/E80A）；突变蛋白的超抗原活性及Zn^2＋对SEC2超抗原活性的影响通过MTT法检测其刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖来验证，而结构稳定性通过对胃蛋白酶及胰蛋白酶的抵抗能力来检测。结果蛋白酶酶切结果与脾淋巴细胞增殖实验结果表明参与第2个Zn^2＋结合的71位及80位谷氨酸残基突变对SEC2的酶解稳定性及超抗原活性没有显著影响；但微量Zn^2＋（10μmol/L）却能显著增强rSEC2的超抗原活性，并且在EDTA存在下，仅有Zn^2＋在一定浓度下才可完全恢复其超抗原活性。结论SEC2分子中的Zn^2＋结合位点的突变对其自身结构稳定性和超抗原活性无显著影响，但SEC2超抗原活性发挥过程中Zn^2＋可能通过其他途径间接影响其超抗原活性。

金黄色葡萄糖球菌肠毒素C2改构蛋白大鼠药动学研究

目的研究金黄色葡萄糖球菌肠毒素C2改构蛋白(2M-118)在大鼠体内单次和多次给药后的药动学特征。方法24只大鼠随机分为3组,每组8只,雌雄各半,分别单次iv低、中和高剂量(1、2和4 mg/kg)2M-118,高剂量组大鼠于单次给药后,继续每天给药1次,共给药8次。于给药前(0 h),首次及末次给药后5、10、20、30、45 min和1.0、1.5、2.0、4.0、6.0、8.0 h采集眼静脉丛全血约0.5 mL,制备血清。采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠血清药物浓度,采用DAS 3.2.8药动程序计算药动学参数。结果大鼠单次iv 2M-118后,在1~4 mg/kg剂量内,峰浓度(Cmax)、初始浓度(C0)和药时曲线下面积(AUC)均与剂量呈正相关;消除相半衰期(t1/2Z)随剂量递增明显延后,平均t1/2z分别为0.24、0.60和1.18 h;表观分布容积(Vz)随剂量递增而增大;各剂量组的清除率(CLz)较为一致。与同剂量(4 mg/kg)单次给药相比,大鼠多次给药后的主要药动学参数基本保持一致,体内药物无蓄积倾向。结论大鼠单次iv 2M-118后,在1~4 mg/kg剂量内,体内暴露量与剂量呈正相关,其清除可能呈现非线性动力学特征;单次与多次iv给予相同剂量2M-118后,药动学行为特征基本一致,无明显药物蓄积。

葡萄球菌肠毒素C2的研究进展

葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxin,SE)是一种外源性超抗原,仅需微量即能高效刺激T淋巴细胞增殖,促使其产生细胞毒作用,并释放大量的细胞因子,引发机体自身免疫应答。大量研究表明,SE是一种很有前途的新型肿瘤免疫治疗制剂,目前国内已将SEC2应用于肿瘤患者的治疗及对肿瘤患者在进行放化疗时防止白细胞降低。该文综述了SEC2在生物学活性、结构特性、抑制肿瘤细胞生长作用等方面的研究进展。

肠毒素C2中Met24对其超抗原活性无重要作用

目的:分析金黄色葡萄球菌肠毒素C2的T细胞受体结合区域α3结构中,第24位甲硫氨酸对其超抗原活性的影响作用。方法:应用定点突变技术对金黄色葡萄球菌肠毒素C2的Met24进行无意义突变,获得突变蛋白SEC2(M24A),对突变蛋白和野生型蛋白的体内、体外超抗原活性进行比较。结果:分别对野生型蛋白及突变蛋白的免疫刺激活性、肿瘤抑制活性、体内致热毒性进行了比较,发现突变蛋白的增值指数(PI)、抑瘤率、热源效应与野生型相比无显著差异(P>0.05),这表明对第24位甲硫氨酸的替换没有对金黄色葡萄球菌肠毒素C2的超抗原活性造成明显影响。结论:在金黄色葡萄球菌肠毒素C2的α3结构中,Met24并不是决定其超抗原活性的重要氨基酸残基。

肠毒素C2蛋白C,N末端对其活性的影响

目的:分析金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)中N,C末端对其超抗原活性和可溶性表达能力的影响。方法:应用基因工程技术对SEC2的N,C末端进行部分删除,获得三种突变蛋白,并对其进行体外超抗原活性和可溶性表达能力的比较。结果:对SEC2的N,C末端的删除都在一定程度上影响其超抗原活性和可溶性表达能力,其中,N末端的两个删除突变体的超抗原活性分别降低40%和48%,而删除C末端则使其可溶性表达水平下降到野生型的20%左右。结论:SEC2蛋白分子的N末端对其超抗原活性起主要作用,C末端对其可溶性表达具有显著影响,而完整的SEC2分子对于其发挥最大生物学活性是必要的。