THE EFFECT OF SUPERANTIGEN STAPHYLOCOCCALENTEROTOXIN B AND D-GALACTOSAMINE ON BALB/CMOUSE HEPATOCYTES

Objective To observe the role of superantigen staphylococcal enterotoxin B(SEB) andD - galactosamine (D - GalN) on Balb/c mouse hepatocytes and its mechanism. Methods After Balb/c mice wereinjected intraperitoneally with SEB, D- GalN or both, blood samples were collected and livers were removed at 2,6, 12, 24h. Patterns of hepatocellular death were studied morphologically and biochemically, circulating cytokines(TNF, IFN-γ) were determined, and mice mortality within 24h was assessed. Results SEB could induce thetypical apoptotic changes of hepatocytes morphologically and biochemically. The mechanism is probably associatedwith the production and release of Cytokines (such as TNF, IFN- γ, etc).D - GalN could induce hepatocytesapoptosis and degeneration at the same time. Besides this, we confirmed hepatocytes of the mice which wereadministered SEB and D - GalN developing apoptosis at 2, 6h, but after 12h hepatocytes were characterized bysevere injury, the mice mortality within 24h is 50%. Conclusion SEB or D - GalN alone could induce the typicalapoptotic changes of hepatocytes. SEB+D-GalN developed hepatocytes apoptosis in the early stage and necrosisin the later. It suggests that there is some relationship between hepatic cell apoptosis and necrosis, and massivehepatocyte apoptosis is the probably initiating step of acute hepatic necrosis in mice.

超抗原SED在大肠杆菌中的表达

目的构建稳定的SED原核表达系统。方法采用PC R技术扩增葡萄球 菌D型肠毒素（SED）超抗原的成熟蛋白编码区DNA序列，构建SED DNA与6个组氨酸基因融合的表达载体pTrcHis-SED，转入E.coli DH5α，IPTG诱导后，用SDS-PAGE和免疫印迹 检测融合蛋白的表达情况。目的蛋白用Ni-NTA金属亲和层析法进行纯化，SDS-PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度。结果成功构建了原核表达载体pTrcHis-SED。分子量 约 为28 000 u的6His-SED融合蛋白可在E.coli DH5α中稳定表达。Ni-NTA金属亲和层析 后得到 纯度较高（>95%）的SED融合蛋白，且具有免疫学活性。结论本研究为SE D免疫识别研究奠定了实验基础。

超抗原SED空间结构的同源建模及其免疫识别位点的预测

目的 对金黄色葡萄球菌肠毒素口 (SED)的空间结构和免疫识别位点进行预测。方法 运用同源建模的方法构建了SED的三维空间结构模型 ,比较SED与其它金黄色葡萄球菌肠毒素超抗原的氨基酸序列、二级结构和空间结构的差异 ,对可能的活性位点进行预测。结果 SED的空间结构与其它肠毒素超抗原相似 ,具有两个结构域 :氨基末端结构域和羧基末端结构域。α 螺旋和 β 折叠可能与维持SED超抗原的空间结构以及与MHC的结合有关 ,而环状区域更多的参与SED与TCR的相互作用。结论 结合已有的研究结果 ,最终确定SED的N2 3、F45、L5 9、N61、I92和F2 0

抗D型葡萄球菌肠毒素单克隆抗体的研制及其初步应用

应用小鼠杂交瘤技术获得５株分泌抗Ｄ型葡萄球菌肠毒素（ＳＥＤ）ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞（ＤＣ３、ＤＣ４、ＤＢ１１、４Ｄ３和４Ｄ５）。其中４Ｄ３为ＩｇＭ（λ），其余为ＩｇＧ１（ｋ）。这组ＭｃＡｂ除ＤＣ３外，其它４株ＭｃＡｂ识别的抗原构象表位相同，其相对亲和力依次为４Ｄ５＞ＤＣ３＞ＤＣ４＞４Ｄ３＞ＤＢｌｌ。利用抗ＳＥＤ多克隆抗体与ＨＲＰ标记的ＤＣ３和４Ｄ３（针对不同表位）混合ＭｃＡｂ建立了夹心ＥＬＩＳＡ法，并以该法检测了自临床标本中分离的８０林金葡萄菌所产生的ＳＥＤ，其产毒率为４１．３％。

原核表达的葡萄球菌D型肠毒素超抗原的纯化及其促淋巴细胞增殖作用

目的 纯化原核表达的葡萄球菌D型肠毒素 (StaphylococcalenterotoxinD ,SED) ,检测其促淋巴细胞增殖活性 ,为SED免疫识别研究奠定基础。方法 用Ni2 + NTA金属螯合亲和层析法纯化 6×His SED融合蛋白 ,SDS PAGE和毛细管电泳检测蛋白纯度 ,BCA法进行定量 ,以3H TdR掺入法检测纯化的SED对人和小鼠淋巴细胞的促增殖活性。结果 获得可满足后续功能实验纯度较高的蛋白质 ;SED对人淋巴细胞的促增殖作用呈质量浓度依赖关系 ,0 .1μg mL时 ,细胞增殖最明显 ;淋巴细胞的增殖与IL 2分泌水平呈正相关。

层析等电聚焦法提纯葡萄球菌肠毒素D

我们成功地建立了层析等电聚焦的三步程序,分离提纯葡萄球菌D型肠毒素。首先用CG-50树脂吸附由细菌培养液中获得粗毒素,然后在PBE94柱上进行层析等电聚焦,最后经过Sephacryls-200过滤。纯化的SED纯度约98%,回收率89%,分子量为28500,pI 7.6。Western blot,免疫双向琼脂扩散的鉴定试验表明,纯化SED与其相应抗血清是特异性反应。

葡萄球菌D型肠毒素超抗原TCR Vβ结合位点的研究

目的 :研究金黄色葡萄球菌D型肠毒素 (SED)超抗原与TCRVβ结合的关键位点。 方法 :利用定点突变技术 ,构建了 6种SED的突变体。用3 H TdR掺入法检测这些突变体促进T细胞增殖的活性。对促增殖活性降低的突变体 ,进一步用流式细胞仪检测他们与MHC Ⅱ类分子结合的活性和其TCRVβ特异性。结果 :发现N2 3位氨基酸是SED与人TCRVβ5结合的关键位点。H2 6位氨基酸可能是SED与人的其他TCRVβ(除TCRVβ5、TCRVβ8和TCRVβ12 .1)结合的关键位点 ,值得进一步研究。结论 :本结果丰富了对超抗原免疫识别的认识 ,为葡萄球菌超抗原相关疾病的防治 。

超抗原SED突变体的构建表达和鉴定

目的 在预测的SED免疫识别活性位点处引入定点突变 ,构建SED突变体。方法 分别设计侧翼引物和突变引物 ,用megaprimerPCR方法引入突变碱基 ,将PCR产物与pTrcHis B质粒连接 ,转化E .coliDH5α ,用IPTG进行诱导表达 ,金属螯合亲和层析法纯化 ,免疫印迹检测纯化的蛋白。结果 测序结果表明在相应的位置引入了正确突变 ,SDS PAGE和免疫印迹检测结果证实了目的蛋白的表达 ,将构建成功的突变体分别命名为SEDN2 3A、SEDN2 3A/H2 6R、SEDF45A、SEDL5 9A、SEDN61A、SEDI92A和SEDF2 0 3A。结论 成功构建了一系列SED突变体 。

产肠毒素D金黄色葡萄球菌的筛选及其基因克隆和蛋白表达

目的克隆金黄色葡萄球菌肠毒素D基因(entD),表达和纯化其重组蛋白(rSED),以进一步制备抗rSED抗体,研制SED金标免疫快速检测试纸条。方法利用PCR技术,从野生型金黄色葡萄球菌中筛选产肠毒素D金黄色葡萄球菌标准株,扩增entD基因,克隆至pGEM-T Easy载体,亚克隆至原核表达载体pET28a,重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化蛋白,免疫印迹检测抗原活性。结果分离获得1株产肠毒素D金黄色葡葡球菌标准株,成功克隆entD序列,测序表明该基因共684 bp,与其他entD序列(GenBank登陆号:M28521)具有99%的同源性。rSED蛋白在大肠杆菌中得到高效的可溶性表达。免疫印迹结果表明,rSED蛋白能被抗天然SED抗体识别。结论通过基因重组技术制备的重组SED蛋白具有良好的免疫反应性。

乳糖诱导葡萄球菌肠毒素A基因在大肠杆菌中的表达

以乳糖作为诱导剂代替传统方法中的IPTG,分别从菌龄、诱导剂浓度、诱导时间及诱导剂的添加方式等方面,对乳糖诱导金黄色葡萄球菌肠毒素A(staphylococcal enterotoxins A,SEA)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达进行了研究。结果表明,重组大肠杆菌表达SEA的优化条件为:在对数生长期(OD600约为0.6),一次性添加终浓度为0.5 mmol/L的乳糖诱导6 h。目标蛋白的表达量占菌体总蛋白质的36.9%,略低于以IPTG为诱导剂时38.1%的表达量。乳糖价格仅为IPTG的1%左右,因此,在SEA的大规模制备中,使用乳糖作为诱导剂可以大大节约成本。

AlphaLISA检测金黄色葡萄球菌肠毒素D

目的利用新型均相化学发光免疫分析技术(AlphaLISA)检测金黄色葡萄球菌肠毒素D(SED),并与传统酶联免疫吸附测定(ELISA)进行比较。方法采用SED单抗偶联发光微球,生物素标记另一SED单抗,以及链霉亲和素偶联感光微球构建SED AlphaLISA检测体系;SED单抗包被,另一生物素标记SED单抗检测,链霉亲和素偶联辣根过氧化物酶(HRP)放大,构建SED ELISA检测体系。结果与结论确定AlphaLISA发光微球和生物素标记抗体的最适稀释比例为1∶50和1∶1000;确定ELISA包被抗体的最适浓度为3μg/ml,生物素标记抗体和链霉亲和素偶联HRP的最适比例分别为1∶1000和1∶2000;AlphaLISA对缓冲液和牛奶模拟样本SED的检出限为100 pg/ml,变异系数(CV)为0.3%~8.9%;ELISA对缓冲液和牛奶模拟样本SED的检出限为781.29 pg/ml,CV为1.0%~19.8%;两种方法均不与其他型肠毒素抗原产生交叉反应。与ELISA相比,AlphaLISA检测SED灵敏度、精确性更高。

环孢菌素对超抗原SEB致小鼠肝损伤的保护作用

用超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB)、D-氨基半乳糖(D-GalN)混合腹腔注射Balb/c/小鼠及预先注射过环孢菌素(CSA)的小鼠,动态观察小鼠肝细胞变化和血清TNF,IFN-γ水平及小鼠死亡率。结果发现SEB+D-GalN注射后2h、6h时出现肝细胞凋亡,12h后出现肝坏死,小鼠24小时死亡率达 50％。小鼠血清 TNF2h升到最高,IFN-γ在 6～12h较高。而预注CSA的小鼠上述指标正常。推测SEB+D-GalN对肝细胞的作用是由T细胞介导的,可被CSA抑制。