山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立一种快速、敏感的ENTV-2检测方法,用于ENT的早期诊断与流行病学调查。【方法】通过生物信息学的方法将ENTV-2与ENTV-1、ERVs、JSRV进行比对,寻找ENTV-2的保守序列并设计1对特异性引物,建立SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法,对所建立的PCR反应条件进行优化,将PCR扩增产物连接T载体构建的阳性质粒作为标准品,对SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的特异性、敏感性和重复性进行验证。【结果】建立的检测ENTV-2 qPCR方法标准曲线呈现良好的线性关系(R^(2)=0.992);该方法的特异性良好,对ENTV-2可以产生特异性扩增曲线,与ENTV-2高度同源的ERVs没有交叉反应,也无法扩增羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Mo)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)等常见病原;敏感性良好,最低检测限度为7.5×10^(2) copies·μL^(-1),敏感性可达常规PCR检测方法的100倍;批内、批间的变异系数CV<1%,重复性良好;对81份临床样品的阳性检出率为17.3%。【结论】建立的SYBR-Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性良好,敏感性较高,重复性良好,为山羊地方性鼻内肿瘤的早期、快速检测提供了技术支持。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和TaqMan探针,建立ENTV-2 TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 TaqMan探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

山羊内源性鼻内肿瘤病毒enENTV-FJ1株全基因组测序及生物信息学分析

为了丰富山羊内源性鼻内肿瘤病毒(enENTV)全基因组序列资源,本研究从1份患羊地方性鼻内肿瘤(ENT)病羊的肾脏中经PCR扩增了1株enENTV全基因组序列,命名为enENTV-FJ1,分别对其全基因组、5’端长末端重复序列(5’LTR)基因、gag基因、env基因及其编码的氨基酸序列进行同源性分析并构建系统进化树,对enENTV的5’LTR进行酶切位点分析,并分析该株病毒的gag、env序列与enENTV、山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)、绵羊鼻内肿瘤病毒1型(ENTV-1)等相关病毒参考株相应序列的差异性。结果显示,enENTV-FJ1基因组结构为LTR-gag-pro-pol-env-LTR,长度为7923 bp;全基因组同源性分析结果显示,enENTV-FJ1株与enENTVCHN1~enENTV-CHN66个参考株的同源性为95.7%~97.3%,同源性最近;与ENTV-2参考株的同源性为87.0%~93.2%;enENTV-FJ1的5’LTR基因序列、gag基因及其编码的氨基酸序列与enENTV参考株相应序列的同源性分别为92.8%~99.1%、92.6%~97.5%、92.2%~97.7%;enENTV-FJ1 env基因及其编码的氨基酸序列与内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)参考株相应序列的同源性分别为93.3%~93.8%、94.3%~94.8%。全基因组进化树结果显示,enENTV-FJ1与enENTV-CHN1~enENTV-CHN6处于同一个进化分支;5’LTR进化树结果显示,enENTV-FJ1株与enENTV-CHN2处于同一进化分支;gag基因进化树结果显示enENTV-FJ1与ENTV-CHN9处于一个小的进化分支,与enENTV-CHN6同处于一个较大的进化分支;env基因进化树结果显示,enENTV-FJ1株与ENTV-2/Spain株处于同一进化分支;所有enENTV的5’LTR区均无ENTV-2参考株所含有的Hpy188Ⅰ、NlaⅣ、MowⅠ这3个酶切位点。gag基因序列分析结果显示,与enJSRV、外源ENTV-2、ENTV-1及绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的gag基因相比,enENTV-FJ1株在697 bp^705 bp有9个核苷酸的插入,该基因编码的氨基酸在aa229~aa232处插入3个脯氨酸。env基因编码的氨基酸结果显示,enENTV-FJ1株与ENTV-2株在aa1~aa7处插入了7个氨基酸(MFVFFRR)。与外源性病毒相比,enENTV-FJ1株在跨膜蛋白(TM)胞质尾区无YXXM基序。上述结果表明,enENTV-FJ1与enENTV属于同种病毒,其5’LTR、gag基因、env基因与来自山羊的ENTV-2病毒株亲缘关系更近;其全基因组序列与外源性ENTV和JSRV的差别主要在5’LTR区、gag基因和env基因。本研究明确了enENTV-FJ1株全基因组序列,为鉴定内外源鼻内肿瘤病毒(ENTV)以及研究ENTV-2的致瘤机制奠定了基础。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒MAb的制备及间接ELISA方法的建立

为建立检测山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的间接ELISA方法,本研究以纯化的ENTV-2免疫BALB/c小鼠,采用间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经3次克隆纯化后获得1株能够稳定分泌ENTV-2特异性单克隆抗体(MAb)的细胞株,命名为6E4,并采用鼠MAb亚类鉴定试剂盒鉴定6E4 MAb的亚类,结果显示,MAb 6E4的亚类为κ链、IgG1亚型。进一步以6E4为检测抗体,经各反应条件的优化建立了检测鼻液样品中ENTV-2的间接ELISA方法,该方法的临界值为0.323。利用该方法检测羊口疮病毒(ORFV)、绵羊肺炎支原体(Movi)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)以及纯化的ENTV-2和ENTV-2患病羊鼻液样品,结果显示,除纯化的ENTV-2及ENTV-2患病羊鼻液样品的检测结果呈阳性外,ORFV、Movi、Mmc的检测结果均为阴性,该方法特异性较强。将纯化的ENTV-2(以蛋白浓度换算)2倍倍比稀释(20μg/mL~0.08μg/mL)后,利用建立的间接ELISA方法检测,结果显示,纯化的ENTV-2稀释至0.3125μg/mL时检测结果仍可判定为阳性,该方法敏感性较高。批内、批间重复性试验结果显示,二者变异系数均小于10%,该方法重复性较好。采用荧光定量RT-PCR方法和本实验建立的间接ELISA方法检测109份临床鼻液样品,比较二者之间的符合率,结果显示,该间接ELISA方法与本研究室前期建立的荧光定量RT-PCR的检测结果符合率达94.5%,表明本研究建立的间接ELISA方法可用于ENTV-2感染的临床快速检测。本研究建立的ENTV-2间接ELISA方法为ENT的净化提供了技术手段。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立山羊地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV-2)快速检测方法,根据ENTV-2 env基因保守区域设计引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,该方法建立的标准曲线在重组质粒浓度为1.019×10^(9)—1.019×10^(2)copies/μL时,相关系数R^(2)为0.998,Ct值和重组质粒浓度有良好的线性关系;与相关的其他5种羊常见病原无交叉反应,最低检测限度为10.19 copies/μL,组间和组内的变异系数均在1.5%内。利用本研究建立的方法与常规RT-PCR对20份临床样品进行对比检测,两种方法的ENTV-2阳性检出率分别为60%(12/20)和30%(6/20),两种方法的总符合率为70%(14/20)。结果表明,本研究建立的方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ENTV-2的诊断和流行病学调查提供技术手段。

山羊鼻内肿瘤病毒广东株的全基因测序与遗传进化分析

为了解山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的基因组特征和遗传变异情况,通过RT-PCR及序列分析方法从广东省某羊场送检病羊组织中鉴定出一株ENTV-2,将其命名为GDZJ2022。全基因组测序结果分析显示,GDZJ2022与GenBank中26株ENTV参考毒株核苷酸序列相似性为86.5%~96.9%,其中与四川ENTV-2-CHN3毒株序列同源性最高(96.9%),并处于同一分支。env核苷酸序列分析结果显示,GDZJ2022与四川株ENTV-2-CHN1同源性最高(98.6%);gag核苷酸序列分析结果显示,GDZJ2022与GDQY-2017同源性最高(95.2%)。

山羊和绵羊地方性鼻内腺癌研究进展

羊地方性鼻内腺癌(ENA)起源于鼻黏膜腺体,是由逆转录病毒ENTV引起的一种接触传染性肿瘤,主要发生于青年及成年山羊和绵羊。临床特征主要表现为持续性鼻漏、呼吸困难、头骨变形。论文重点论述了该病的病原,并结合ENTV的免疫学特性对该病的诊断与防控方法进行了比较,以期为该病的预防及早期诊断提供参考资料。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒Shaanxi株前病毒全基因组克隆及生物信息学分析

为研究山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV)Shaanxi株前病毒全基因组序列,本研究根据Gen Bank中收录的ENTV前病毒基因组序列设计5对引物,通过PCR方法从肿瘤组织中分段扩增获得了ENTV前病毒全基因组的5个片段,测序并分析。结果显示该病毒基因组全长7 275 bp,包含相互重叠的gag-pro-pol-env编码区及5'端非编码区;ENTV Shaanxi株基因组全序列与NC004994.2、AY197548.2、ENTV-SC株(HM104174.1)核苷酸同源性分别为89%、89%、99%。本研究为ENTV的分子生物学特性研究提供资料,为进一步研究其检测方法与致病机理奠定了基础。

山羊地方性鼻内腺瘤病毒和内源性逆转录病毒gag变异区的克隆与分析

根据病毒gag变异区的两端设计引物,PCR扩增ENTV及ERVs的gag变异区,TA克隆并测序,经比对分析发现,在ERVs的783位~803位的＂CCT＂重复序列,编码多聚脯氨酸＂PPPPPPP＂,对应在ENTV gag中存在缺失突变和点突变,编码氨基酸为＂PSL＂,生物信息学预测该区域的变异位于一个重要的抗原决定簇中,对gag在ENTV和ERVs中的功能有较大影响,为进一步研究gag的抗原性及相关免疫学检测方法的建立奠定基础。

一起山羊地方性鼻内肿瘤的诊断

陕西省某山羊养殖场发生一起山羊鼻内肿瘤病,通过流行病学和临床症状调查、病理剖检、病理切片检查进行初步诊断。其次根据GenBank收录的山羊地方性鼻内肿瘤病毒基因组序列设计1对特异性引物,通过PCR方法从肿瘤组织中扩增获得目的片段并测序。序列比对分析表明,该目的基因和山羊地方性鼻内肿瘤病毒高度相似,最终确定该病为山羊地方性鼻内肿瘤病毒引起的山羊地方性鼻内肿瘤(ENT)。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒的gag基因克隆及分析

安徽省某山羊场内部分羊只发生羊鼻漏,面部一侧肿胀,进行病理剖检观察后,取面部皮下肿瘤组织研磨,提取RNA,用特异性引物通过RT-PCR方法扩增获得目的片段并测序。序列比对分析表明,获得的目的基因和山羊地方性鼻内肿瘤病毒的同源性最高,达99%。结果显示,此羊场的山羊感染了由山羊地方性鼻内肿瘤病毒引起的山羊地方性鼻内肿瘤。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的表达及其多克隆抗体的制备和特性分析

【目的】明确山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)SU蛋白的功能。【方法】采用RT-PCR方法从ENTV-2FJ分离株中扩增获得SU基因片段,将其克隆到pMD-19T载体;测序验证后,再亚克隆到PET-32a(+)上,在RosettagamiB(DE3)感受态细胞进行表达,采用SDS-PAGE、Western-blot和ELISA对重组蛋白进行鉴定及抗原性分析。【结果】结果显示,表达的重组菌融合蛋白大小约64.38 kD,在IPTG终浓度0.4 mmol·L^(−1)、37℃诱导4 h表达效果最好。用纯化的ENTV-2进行SDS-PAGE,SU重组蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体作为一抗,进行Western-blot,结果显示鼠抗SU蛋白多克隆抗体能与ENTV-2抗原进行特异性的反应。【结论】表达的SU蛋白有较好的抗原性,为制备ENTV-2特异性单克隆抗体及建立ENTV-2特异性血清学方法奠定了基础。

羊地方性鼻内腺瘤的研究进展

羊地方性鼻腺瘤(ENA)是绵羊和山羊的病毒性传染疾病,其特征在于鼻腔中的筛骨黏膜的肿瘤生长,已对羊养殖业造成严重的经济损失。为了对该病有更深入、全面的了解,本文主要从病原学、流行病学、临床症状和病理变化、诊断技术以及防治等方面对羊地方性鼻内腺瘤进行了综述。

山羊鼻内肿瘤病毒荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为了解山羊鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)的流行情况,本研究针对ENTV-2的env基因设计了1对特异性引物与探针,通过RT-PCR条件优化,成功建立了ENTV-2荧光RT-qPCR检测方法。该方法特异性高、灵敏性强(5.61 copies/μL)、重复性好(CV为0.09%~1.20%)。本研究建立的一步法荧光RT-qPCR方法为ENTV-2的临床检测以及流行病学调查提供技术支撑。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV-SC株基因组cDNA文库的构建及生物信息学分析

根据山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)基因组序列设计5对引物,通过RT-PCR技术从山羊地方性鼻内肿瘤自然感染病例的鼻液中分段扩增获得了ENTV的基因组,构建了ENTV的cDNA文库,并对基因组序列进行了生物信息学分析。结果显示,获得的序列全长7 168bp,包含相互重叠的gag-pro-pol-env编码区及部分5′端非编码区,属B/D型病毒粒子。ENTV-SC与ENTV-2(2003年测序)高度相似,LTR、gag、pro、pol、env基因的相似性分别为91.0%、88.0%、88.6%、89.3%和91.0%。ENTV-SC与EN-TV-1及绵羊肺腺瘤病毒相似,主要差异存在于gag、env的跨膜区及LTR。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒ENTV/CH/GT/2015株全基因组cDNA文库的构建及生物信息学分析

为获得山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)古田株(暂命名为:ENTV/CH/GT/2015株)全基因组序列。通过PCR方法从山羊鼻内肿瘤组织中分段扩增获得ENTV-2全基因组7个片段,目的片段经胶回收后分别连接至pMD19-T载体上,并转化至基因工程菌DH5a,提取阳性质粒进行测序,利用生物学软件对获得的序列进行拼接分析。获得ENTV/CH/GT/2015株全基因组序列长度为7506 bp,包含相互重叠的gag-pro-pol-env编码区及5′端非编码区,并上传至GenBank上获得登录号为MK210250.1;与国外NC004994.2株和AY197548.2株核苷酸同源性均为87.5%,与国内ENTV-2CHN8株核苷酸同源性为97.7%。氨基酸序列分析结果显示,gag蛋白在124~126 aa插入GVE 3个氨基酸和229~232 aa插入APPP 4个氨基酸,env蛋白在590~593 aa处存在AESL 4个氨基酸的缺失;gag和env蛋白抗原表位分析结果显示,尽管存在氨基酸的突变和缺失,但抗原表位并没有明显差异。糖基化位点预测结果显示:gag、pro、pol和env蛋白分别含有1,1,4,6个糖基化位点,均可能不包含信号肽。遗传进化树分析结果推测,该毒株是国内ENTV-2CHN2株和ENTV-2CHN10株变异毒株。本研究获得ENTV/CH/GT/2015株全基因序列并明确其生物学特性,不仅丰富了ENTV-2全基因序列库,还为今后研究ENTV-2快速检测方法及致病机理提供了研究素材。

山羊鼻内肿瘤病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的山羊鼻内肿瘤病毒(ENTV)SC株的基因序列,设计合成了1对特异性引物,通过对反应条件进行优化,建立了一种快速检测ENTV的RT-PCR方法。结果显示,以该引物进行RTPCR扩增,能得到与理论设计值大小相符的323bp的特异性条带;与ENTV-SC株相应序列的同源性达98%;该方法最低可检测出6pg的ENTV;用此方法对健康山羊鼻黏膜上皮、健康牛鼻黏膜上皮、绵羊肺腺瘤病毒、肺炎球菌和大肠杆菌的扩增结果均为阴性,重复性和稳定性好;对随机收集的100份山羊样品进行检测,并与临床诊断结果进行比较,符合率为100%。结果表明,此方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性均好,可用于山羊鼻内肿瘤病毒的临床检测和试验研究。

山羊地方性鼻内肿瘤病毒SU蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

为获得纯化的山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats,ENTV)表面蛋白(surface protein,SU protein)和抗SU蛋白的多克隆抗体,根据Gen Bank已登录的ENTV Shaanxi株SU基因序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增SU基因并将其连接于原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒p ET-28a-SU,经鉴定正确后转化大肠杆菌Rosetta(DE3)株进行诱导表达,并进行SDS-PAGE分析。重组菌经IPTG诱导后成功表达出分子质量为43 ku的重组蛋白。将诱导表达的蛋白经镍柱亲和层析纯化、复性后免疫小鼠制备多克隆抗体。Western-blot分析结果表明,原核表达纯化的SU蛋白能够与制得的小鼠抗SU蛋白多克隆抗体特异性结合。上述结果表明,本试验成功获得了纯化的ENTV SU蛋白和小鼠抗ENTV SU蛋白的多克隆抗体,为进一步研究SU蛋白在ENTV感染过程中的作用和建立诊断方法提供了材料。