EoNPV对灰茶尺蠖的致病特性及高效毒株筛选

茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedronviruses,Eo NPV)是茶尺蠖的重要天敌。灰茶尺蠖(Ectropis grisescens Warren)是茶尺蠖的近缘种,也是茶树主要害虫。为了探明应用Eo NPV防控灰茶尺蠖的效果,发挥其对灰茶尺蠖的生物防治作用,通过生物测定,研究了Eo NPV对灰茶尺蠖的致病特性,并进行了高效毒株的筛选。结果表明,Eo NPV对灰茶尺蠖1龄幼虫致病力最强,2×104~2×108PIB·m L-1处理对1龄幼虫的致死率达82.7%~100%;对灰茶尺蠖2龄幼虫的LC50值为2.32×106PIB·m L-1(饲毒后9 d);对不同代别灰茶尺蠖的致病力有明显差别,以第2代为最高。从用灰茶尺蠖连续增殖5代的病毒样品中,筛选出高效毒株QF4,该毒株对灰茶尺蠖致死率比原始毒株提高51.5%,致死中时间缩短1.5 d。研究表明,应用Eo NPV防治灰茶尺蠖最适宜在第2代1龄期施用;QF4可作为病毒生产用毒株。

不同地理种群茶尺蠖对EoNPV的敏感性差异研究

采集来自浙江、湖南、湖北和江苏省的7个不同地理种群茶尺蠖,用茶尺蠖核型多角体病毒（EoNPV）进行室内生物测定,结果表明不同地理种群茶尺蠖对EoNPV敏感性存在明显差异。浙江杭州种群和江苏宜兴种群对EoNPV的敏感性较高,饲毒后11 d幼虫全部死亡,致死中浓度（LC50）分别为8.32×104 PIB/mL和8.61×104 PIB/mL;其他5个地理种群茶尺蠖对EoNPV的敏感性较低,饲毒后11 d的死亡率均在30%以下,致死中浓度LC50在1.35×107~6.03×107 PIB/mL之间;其中敏感性最低的浙江衢州种群和敏感性最高的江苏宜兴种群毒力差异达724.5倍。

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)的PCR检测方法及其生物活性研究

根据茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)多角体蛋白基因建立了PCR检测方法,在茶尺蠖子代卵和蛹内检测到EoNPV存在,灵敏度达到1 fg,此方法可用于田间施用EoNPV后茶尺蠖种群带毒检测。PCR方法由于操作简单、检测灵敏度高、特异性好、重复性好等优点,值得应用。利用EoNPV感染茶尺蠖2龄幼虫,幼虫对EoNPV的敏感性很高,测得LC50为2.2×104PIB.mL-l,EoNPV感染浓度越高,则幼虫死亡越快,幼虫死亡时间与感染浓度呈正相关。

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)实时荧光定量PCR检测方法的优化及应用

选用茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)基因组中序列特异性很高的p16基因为目标基因,通过设计引物、PCR扩增、目的片段与载体连接转化获得含p16基因的重组质粒进行测序,进而以经测序鉴定的p16基因的PCR纯化产物作为实时荧光定量PCR标准品模板,稀释后建立SYBR Green I荧光定量标准曲线,统计分析显示标准品浓度的对数值与Ct值之间存在良好的线性关系(R2=0.9981)。该方法的检测灵敏度为102,扩增产物形成单一的特异性熔解峰,组内组间变异系数均小于3%。同时分别对含有其他茶树害虫病毒和不同浓度的茶尺蠖病毒产品的样品进行检测,能明确样品中是否含有EoNPV及含量。根据已建立的方法对感染病毒后不同时间段的茶尺蠖幼虫进行检测,每克幼虫样本内p16基因拷贝数的增殖倍数对数值与感染时间呈正相关(R2=0.9935),可以获得茶尺蠖幼虫感染病毒后不同时间的增殖动态。上述结果表明,该方法能定性定量鉴定茶尺蠖核型多角体病毒,可用于茶尺蠖核型多角体病毒类生物农药的检测和感染过程检测。

茶尺蠖对不同品系EoNPV敏感性的地理差异研究

就8个省份(湖北、河南、浙江、江西、福建、安徽、湖南和贵州)茶尺蠖种群对2个品系EoNPV-Z(中国农科院茶叶研究所提供)和EoNPV-W(湖北农科院果茶研究所提供)的敏感性差异进行研究。结果表明,浙江种群接种EoNPV-Z后死亡速度最快,接种13 d后,死亡率达到100%,致死中浓度(LC50)为1.78×104PIB/mL,而河南种群对EoNPV-Z的敏感性最低,与浙江种群的差异性达553.4倍;浙江种群对EoNPV-W亦最敏感,致死中浓度(LC50)为3.73×104PIB/mL,而贵州种群的抗性最强,LC50是浙江种群的163.5倍;对两株病毒的致死中时间(LT50)进行比较,EoNPV-W除对贵州种群的LT50大于EoNPV-Z外,对其他种群的LT50均小于EoNPV-Z。综合考虑LC50和LT502个参数,EoNPV-Z对浙江和贵州两种群茶尺蠖的致病效果较好;而EoNPV-W对其他6个种群茶尺蠖的致病力相对较强。

EoNPV不同品系的致病力及增效作用的研究

测定了两品系EoNPV对信阳茶尺蠖种群幼虫的毒力及茶皂素和卵磷脂对其的增效作用.结果表明:W-EoNPV(湖北省农业科学院果茶研究所提供)的毒力强于Z-EoNPV(中国农业科学院茶叶研究所提供).用1,2,4mg/mL茶皂素和EoNPV混用,最高质量浓度(4mg/mL)可显著提高Z-EoNPV和W-EoNPV对茶尺蠖的毒力,接种14d后,其死亡率比单用病毒分别提高了16.34%和13.22%.2mg/mL茶皂素对Z-EoNPV有显著的增效作用,14d后的防治效果提高了12%,但对W-EoNPV的效果不明显.而茶皂素最低质量浓度(1mg/mL)对2株病毒基本无增效作用.卵磷脂各质量浓度可提高W-EoNPV对茶尺蠖的致死率,接种14d后,质量浓度由高至低分别使死亡率提高16.25,6.25和4.1个百分点,而卵磷脂对Z-EoNPV的增效作用极不明显.茶皂素和卵磷脂的最高质量浓度与EoNPV混合使用均可缩短LT50,但低质量浓度不明显.

两近缘种茶尺蠖的抗菌肽基因在抵抗EoNPV感染过程中的表达差异

小茶尺蠖Ectropis obliqua Prout和灰茶尺蛾Ectropis grisescens Warren是危害茶园的两近缘种害虫。用小茶尺蠖核型多角体病毒E.obliqua nucleopolyhedrovirus(Eo NPV)喂饲两近缘种茶尺蠖,10 d后小茶尺蠖的死亡率为100%,而灰茶尺蛾的死亡率仅为35.5%。以感染病毒的两近缘种3龄幼虫的cDNA为模板,采用RT-PCR技术克隆获得了gloverin、attacin和moricin 3个抗菌肽基因,通过邻位连接法构建系统发育树聚类分析显示小茶尺蠖和灰茶尺蛾的Gloverin、Attacin和Moricin蛋白均分别归为一个分支;进一步采用qPCR检测发现,病毒处理后gloverin、attacin和moricin 3个基因在两近缘种茶尺蠖体内均表达上调,gloverin基因在12 h达到最大值,moricin基因在48 h达到最大值,且gloverin和moricin基因在灰茶尺蛾中表达量显著高于小茶尺蠖,而attacin基因在病毒侵入后的不同时期在两近缘种茶尺蠖体内表达量是变化的,推测gloverin、moricin和attacin基因可能与病毒的侵入有关。这一研究结果为进一步揭示抗菌肽基因在昆虫与病毒互作中的作用打下了基础。

Bt与EoNPV混用配比优劣性图谱分析

苏云金杆菌(Bt)和茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)等,两类生物源杀虫剂常以复配混用方式应用。由于药效的迟缓,而明显表现出剂量-时间-致死作用复合特征。但目前尚缺乏与之相适应的混用配比优劣判别标准。受叶庆华等地学信息图谱分析和曹进等指纹图谱整体相似性分析理论和方法的启发,用室内人工饲养繁殖茶尺蠖2龄初—中期幼虫生物测定结果作为基础数据,分析研究了Bt与EoNPV混用的剂量-时间-致死作用复合特征,并进行了配比优劣性判别的尝试。首先将生物测定的有关结果输入SPSS统计分析软件包和Excel绘图软件,进行多因素方差分析,同时分别绘出不同药剂处理的,以剂量梯度为横轴,以累加死亡虫数为纵轴的不同观察时段害虫致死过程的曲线组图,简称时段药效信息图;再使用SPSS软件包进行单因素方差分析,提取出用于整体相似性比较的图谱单元Ⅰ和用于细节非相似性比较的图谱单元Ⅱ,且分别量化,由此得到相似值和非相似值,据此又分别算得相似系数和非相似系数;最后综合成一种混用配比优劣性总体判别指标,简称Q值。结果,Bt∶EoNPV为9∶1、7∶3、4∶1和2∶3等4个混配处理的Q值依次为200、100、31.0和23.8,明显标示了其中“9∶1”的Q值最大,被确认为最合理的混配处理。此结果与之前的研究相同。还对该图谱分析方法的可靠性以及应用的可行性等进行了讨论。

两个EoNPV毒株对茶尺蠖和灰茶尺蠖的毒力差异

通过确定不同茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrovirus,EoNPV)毒株对茶尺蠖(Ectropis obliqua)和灰茶尺蠖(Ectropis grisescens)毒力水平的差异,为有效提高茶尺蠖病毒的防效提供理论基础。采用浸渍法,测定EoNPV浙江毒株(EoNPV-ZJ)和江西毒株(EoNPV-JX)对茶尺蠖和灰茶尺蠖3龄幼虫的毒力水平;通过克隆测序,多重比较分析EoNPV-ZJ和EoNPV-JX毒株同源重复区(hrs)。结果表明,EoNPV-JX对灰茶尺蠖和茶尺蠖3龄幼虫14 d的LC50分别为5.95×10^(6) PIB·mL^(-1)和3.14×10^(6) PIB·mL^(-1),EoNPV-ZJ对灰茶尺蠖和茶尺蠖3龄幼虫14 d的LC50分别为1.13×10^(7) PIB·mL^(-1)和5.04×10^(6) PIB·mL^(-1)。EoNPV-JX和EoNPV-ZJ的hr1大小均为1795 bp,含有11个完全回文序列,hr3大小均为665 bp,含有3个完全回文序列,与已报道的安徽毒株(EoNPV-AH)无差异;而hr2差异较大,其中EoNPV-JX hr2为864 bp,含有7个完全回文序列,EoNPV-ZJ hr2为1168 bp,含有12个完全回文序列,均少于EoNPV-AH的18个完全回文序列。综合分析显示,EoNPV不同毒株对茶尺蠖的毒力水平高于其近缘种灰茶尺蠖;EoNPV-JX毒株对灰茶尺蠖的毒力高于EoNPV-ZJ毒株,造成EoNPV不同毒株毒力差异的主要原因可能与其hr2序列回文序列个数相关。

EoNPV的限制性酶切图谱及polyhedrin基因和egt基因的定位

用８种限制性内切酶酶解茶尺蠖Ｅｃｔｒｏｐｉｓｏｂｌｉｑｕａ核型多角体病毒（ＥｏＮＰＶ）基因组ＤＮＡ，获得大于０．８８ｋｂ的片段数分别为７、３８、１９、１７、１６、９、３２和１４．由此统计，基因组平均大小大于１１８．５ｋｂ，即Ｍｒ约大于７８．６×１０６．用ＢｍＮＰＶ的多角体蛋白（ｐｈ）基因和ＡｃＭＮＰＶ的ｅｇｔ基因为探针，应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交方法，将ＥｏＮＰＶ的ｐｈ基因定位于ＢａｍＨＩＡ、ＣｌａＩＤ、ＥｃｏＲＩＭ、ＥｃｏＲＶＬ、ＨｉｎｄⅢＦ、ＰｓｔＩＡ、ＳａｌＩＨ和ＸｈｏＩＢ片段上，将ｅｇｔ基因定位于ＢａｍＨＩＡ、ＣｌａＩｌ、ＥｃｏＲＩＫ、ＥｃｏＲＶＡ、ＨｉｎｄⅢＨ、ＰｓｔＩＡ、ＳａｌＩＢ、ＸｈｏＩＩ片段上．通过克隆和酶切鉴定ＥｃｏＲＩＭ和ＥｃｏＲＶＬ片段，测定ｐｈ基因部分序列，并以ＥｃｏＲＩＭ为探针对基因组酶切印迹进行杂交，制作了ＥｏＮＰＶｐｈ基因和ｅｇｔ基因区的酶切图谱，推定ｅｇｔ基因保守区位于ｐｈ基因上游约４．５５ｋｂ处．

EoNPV对茶尺蠖两近缘种的毒力差异

茶尺蠖核型多角体病毒(Ectropis obliqua nucleopolyhedrosis virus,EoNPV)是一种重要的病原微生物,为进一步明确该病毒对茶尺蠖两近缘种的毒力差异,采用叶盘法对3龄茶尺蠖和灰茶尺蠖幼虫进行了EoNPV的毒力测定。研究显示,EoNPV对灰茶尺蠖的半致死剂量LD50(median lethal dose)为茶尺蠖的28.9倍,EoNPV对灰茶尺蠖的致死中时间LT50(median lethal time)大于茶尺蠖。结果表明,EoNPV对茶尺蠖两近缘种间的毒力存在差异,EoNPV对茶尺蠖具有更高的致病力,研究结果对EoNPV田间防治茶尺蠖两近缘种具有现实指导意义。

三种主要环境因子对茶尺蠖核型多角体病毒毒力的影响

本文对温度、紫外线和茶园露水对茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)毒力的影响进行了研究。结果表明,在18—26℃下,适于病毒感染各龄幼虫,幼虫病死率达100％;但在30、34℃下,除1龄初饲毒外,病死率、化蛹率和羽化率明显下降或上升,3龄初或其以后饲毒,74％以上幼虫能化蛹,89％以上蛹能羽化。离体病毒经45℃处理2天,毒力开始明显减退。紫外线照射2—8分钟,离体病毒毒力减退不明显;照射16分钟,毒力开始明显减退。紫外线对离体病毒的影响与温度及病毒浓度有关。茶园露水对离体病毒无明显影响。

茶尺蠖核型多角体病毒制剂的研制

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)是茶尺蠖的主要病原微生物。试验研制了3种EoNPV制剂,分别是EoNPV乳剂、EoNPV-Bt乳剂、EoNPV-溴氰可湿性粉剂。3种制剂在室内和田间对茶尺蠖的防治效果均在90%以上。茶园示范应用1万hm2,经济效益和生态效益明显。并对3种制剂的田间使用技术进行了研究和讨论。

可感染茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒的构建

【目的】构建能够感染家蚕和茶尺蠖的重组家蚕核型多角体病毒(rBmNPV),解决EoNPV扩增困难而不易获得的难题。【方法】通过Bac-to-Bac系统构建具备BmNPV的多角体蛋白基因(polh)表达盒和EoNPV的解旋酶基因(hel)表达盒的重组家蚕核型多角体病毒。【结果】家蚕或家蚕细胞扩增的rBmNPV可以感染茶尺蠖并致病,表明rBmNPV的宿主域拓展至茶尺蠖。【结论】成功构建了能够感染茶尺蠖的rBmNPV,为利用家蚕作为宿主来生产重组病毒杀虫剂打下基础。

茶尺蠖病毒杀虫剂田间使用技术的研究

茶尺蠖病毒杀虫剂应在每年茶尺蠖第1、2代和第5、6代的1～2龄幼虫期使用。在7.5×10~9～15.0×10~9PIB/hm^2的使用剂量下,幼虫期的防治效果可达98％以上。采用不同的喷雾器、不同的用水量及不同的喷施方式喷施,对防治效果无影响。但挑治和丛面喷施可大幅度节约防治成本费。

茶尺蠖核型多角体病毒制剂的防治效果

茶尺蠖核型多角体病毒（Ectropis obliqua nuclear polyhedrosis virus,简称 EONPV）的两种制剂 EONPV 2H2 的 Lc50为2.5×104 PIB/m1、EONPV 2H4的Lc50为2×104 PIB/ml,以1×107 PIB/ml的 EONPV 2H2感染寄主3龄虫的 Lt50为5.5天,EONPV 2H4 的 Lt50为5.7天。两制剂均有一定的防紫外光能力,对寄主的致病性强,室内试验校正死亡率都在96%以上,大田每亩用200亿 PIB,对第1、2、5（年发生5代区）和6代防治效果多在90%以上。在茶园中使用安全,对异色瓢虫等茶园天敌组织细胞的电镜检查,未发现有该病毒的多角体和病毒粒子,对单白绵绒茧蜂没有直接的致病性。

温度对茶尺蠖核型多角体病毒形态发生的影响

电镜观察结果表明,26℃下茶尺蠖核型多角体病毒形态发生正常,其过程可分成病毒发生基质的形成—核衣壳的形成—病毒粒子的形成—多角体成熟四个阶段,一个细胞核切面可见1～50,甚至更多的多角体,30℃下则其形态发生受阻,开始饲毒后168小时内,宿主中肠上皮细胞和脂肪体细胞核中均未见病毒有关结构,仅观察到染色质凝集块,这应是高温季节该病毒防治效果差的重要原因之一。 此外,在26℃下饲毒所得宿主细胞切片中,还观察到了核内的大量管状物,特长病毒粒子及内含纤维物的具双层膜的囊状物,核内和细胞质中具侧膜的成束纤维状物等特殊结构。

茶尺蠖病毒研究进展

茶尺蠖是茶树上一种重要的食叶性害虫,分布于我国各茶区,经常在局部茶园暴发成灾,对茶叶生产造成严重的损失。茶尺蠖病毒是控制茶尺蠖自然种群消长的重要因子,主要包括茶尺蠖核型多角体病毒和茶尺蠖小RNA病毒。本文综述了茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)生物学特性、扩繁、制剂的研发与应用、定性定量检测技术的建立、重组NPV病毒和茶尺蠖小RNA病毒分子生物学方面的研究进展情况,为更好的利用病毒防治茶尺蠖提供参考。

茶尺蠖核型多角体病毒SalI 1·1 k片段的克隆及gp41部分序列分析

茶尺蠖核型多角体病毒(EoNPV)是尚未完成基因组测序的一种杆状病毒。为了解其基因组的信息,从病虫中分离纯化了茶尺蠖NPV,提取基因组DNA,构建了EoNPV DNA的SalI酶切片段文库,并对阳性克隆进行测序,获得了EoNPVgp41基因的部分序列。序列同源性分析结果表明,EoNPV与LdMNPV之间gp41基因的同源性较高,而与AcMNPV及BmNPV的同源性较低。