EphB/EphrinB信号通路对成骨分化能力的影响

目的探讨EphB/EphrinB信号通路对去势小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化能力和绝经后骨质疏松动物模型骨量的影响。方法将24只8周龄健康雌性BALB/c小鼠随机分为去势组(OVX组)和假手术组(Sham组),检测小鼠BMSCs中EphB/EphrinB信号通路表达水平。(2)将去势小鼠分为4组,分别进行腹腔注射相应Eph受体激动剂:EfnB1-Fc及EfnB2-Fc,Eph受体抑制剂EphB2-Fc,对照组腹腔注射human IgG-Fc。各组分别于术后10周将小鼠脱颈处死,在Micro-CT分析下比较股骨骨质情况。去势组和假手术组小鼠取股骨与胫骨骨髓,经密度梯度离心法分离培养并鉴定其骨髓间充质干细胞至P3用于实验,各组BMSCs在成骨诱导条件下7 d后,通过Realtime PCR检测成骨相关基因(Runx2、ALP、Osterix)及破骨细胞分化相关基因(OPG、RANKL)的表达水平,成骨分化14、21 d后,采用ALP染色和茜素红染色观察成骨分化能力。结果与假手术组(Sham组)相比较,去势组(OVX组)中EfnA2、EphB4、EfnB2、EfnB1及EphA4表达显著增高(P<0.01);Sham组中EphA2及EfnB2表达显著降低(P<0.01)。10周后Micro-CT结果显示,与去势对照Fc组比较,Sham组、EfnB1-Fc、EfnB2-Fc及EphB2-Fc去势组骨小梁结构均较完整、骨小梁密度较好(P<0.01);与EfnB1-Fc、EfnB2-Fc去势组相比较,Sham组和EphB2-Fc去势组的骨密度及骨体积分数均明显增高(P<0.01)。Realtime PCR检测成骨相关基因提示,与去势对照Fc组比较,EfnB1-Fc、EfnB2-Fc和EphB2-Fc去势组中ALP与Osterix的表达明显升高(P<0.01);EfnB1-Fc和EphB2-Fc可显著提高BMSCs成骨分化中ALP的活性和骨基质矿化能力,以EphB2-Fc效果最为显著(P<0.01)。与去势对照Fc组比较,EfnB1-Fc、EfnB2-Fc和EphB2-Fc去势组中RANKL的表达未见明显差异(P>0.05),但OPG的表达明显升高(P<0.01),其中,EfnB1-Fc去势组与EphB2-Fc去势组中OPG/RANKL的比率升高最为明显(P<0.01)。结论EphB2/EfnB1双向信号通路可逆转去势所导致的骨量减少,上调ALP与Osterix的表达,促进BMSCs的成骨分化能力,并可通过调节OPG/RNAKL比率影响去势骨髓间充质干细胞的功能,从而间接影响破骨细胞系的分化。

电针对大脑中动脉梗塞大鼠EphrinB2/EphB2信号通路上突触重塑相关因子的影响

目的:观察电针对大脑中动脉梗塞模型(MCAO)大鼠促红细胞生成素产生肝细胞配体-B2(erythropoietin-producing hepatocyte receptor interacting protein-B2,Ephrin B2)/受体-B2(erythropoietin-producing hepatocyte receptor-B2,Eph B2)信号通路上突触重塑相关因子表达的影响,以期揭示针刺治疗脑缺血的可能机制。方法:120只雄性SD大鼠随机分为假手术组、模型组、穴位组、非穴位组(n=30);各组再分为术后3d,14d及21d三个亚组(n=10)。除假手术组外,其余各组大鼠用Zea-longa线栓法制备MCAO模型;穴位组和非穴组电针治疗,其余两组只绑不针。对大鼠行神经功能评分,采用免疫组化、免疫荧光和蛋白质印迹法行相应指标检测。结果:模型组术后3d梗死灶周Ephrin B2/Eph B2表达明显减少,但随时间呈递增趋势,21d恢复到假手术水平。穴位组较模型组和非穴组增加更明显,术后21d表达高于假手术组(P<0.05)。Ras相关的C3肉毒毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate-1,Rac-1)和微管相关蛋白-2(microtubule-associated protein-2,MAP-2)的表达随时间逐渐递增,且均与神经功能改善相吻合;其中穴位组增加最明显,术后21d超假手术组水平(P<0.05)。结论:Ephrin B2/Eph B2信号通路参与了MCAO大鼠突触重塑,电针肝俞、肾俞穴可能通过激活Ephrin B2/Eph B2信号通路,促进MCAO大鼠神经功能的康复。

EphrinB2/EphB4-Fc蛋白片段腹腔注射对去卵巢小鼠骨质疏松的防治作用

目的探讨腹腔注射促红细胞生成素肝细胞激酶受体配体B2(EphrinB2)/促红细胞生成素肝细胞激酶受体B4(EphB4)蛋白片段对去卵巢小鼠骨质疏松的防治效果。方法取7周龄健康雌性C57BL/6小鼠39只,随机分为假手术组、模型组、干预组,每组各13只。模型组、干预组通过摘除小鼠卵巢组织建立绝经模型,假手术组仅切除卵巢组织周围脂肪组织。造模术后1周,干预组给予腹腔注射EphrinB2-Fc蛋白片段以及EphB4-Fc蛋白片段0.1 mg/(kg·d),假手术组和模型组注射等量生理盐水,继续喂养16周。小鼠脱颈处死,取出股骨,采用力学测试机测试三点弯曲力学性能,获得弹性模量、最大载荷;取腰椎、股骨和颅骨,采用双能X线骨密度检测仪检测骨密度和骨小梁厚度;取第5腰椎和远端股骨,采用抗酒石酸酸性磷酸酶染色法检测破骨细胞数量;采集小鼠腹主静脉血,酶联免疫吸附法检测血清碱性磷酸酶(ALP)、脱氧吡啶啉(DPD)。取小鼠股骨和胫骨,收集骨髓腔冲洗液中的细胞,采用RT-PCR法检测EphrinB2、EphB4 mRNA,Western blotting法检测EphrinB2、EphB4蛋白。结果与假手术组相比,模型组骨弹性模量、最大载荷降低;与模型组相比,干预组骨弹性模量、最大载荷升高(P均<0.05)。与假手术组相比,模型组骨密度、骨小梁厚度降低;与模型组相比,干预组骨密度、骨小梁厚度升高(P均<0.05)。模型组破骨细胞数量多于假手术组和干预组(P均<0.05)。与假手术组相比,模型组血清ALP、DPD水平降低;与模型组相比,干预组血清ALP、DPD水平升高(P均<0.05)。与假手术组相比,模型组骨组织EphrinB2、EphB4 mRNA和蛋白表达水平下降;与模型组相比,干预组骨组织EphrinB2、EphB4 mRNA和蛋白表达水平升高(P均<0.05)。结论过表达EphrinB2/EphB4信号通路蛋白能够改善去卵巢小鼠的骨力学性能,减少破骨细胞数量,提升骨代谢指标,从而防治绝经后骨质疏松。

EphB3通过PI3K/AKT信号通路对胶质瘤细胞侵袭及迁移的影响

目的探究促红细胞生成素产生的肝细胞受体B3(EphB3)通过PI3K/AKT信号通路对胶质瘤的侵袭、迁移的作用机制。方法通过EphB3慢病毒过表达及EphB3-siRNA感染U87MG、U251细胞系,采用细胞划痕实验、细胞侵袭(Transwell)实验检测细胞的侵袭、迁移能力,采用蛋白印迹法(Western Blot)检测EphB3过表达及siRNA干扰后磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的蛋白表达,采用细胞多重免疫荧光检测EphB3的过表达及敲低检测EphB3、p-PI3K、p-AKT共表达情况;收集Ⅰ~Ⅳ级胶质瘤组织样本40例,采用免疫组化检测EphB3的表达,组织多重免疫荧光检测EphB3及p-PI3K、p-AKT的共表达。结果U87MG、U251细胞系过表达EphB3后细胞侵袭、迁移能力减弱(P<0.05),敲低EphB3后U87MG、U251细胞侵袭、迁移能力增强(P<0.05);EphB3过表达后p-PI3K、p-AKT表达下降(P<0.05),EphB3敲低后p-PI3K、p-AKT表达升高(P<0.05);临床胶质瘤组织样本结果显示,EphB3的表达与胶质瘤WHO分级呈负相关;多重免疫荧光结果显示,胶质瘤的级别与p-PI3K、p-AKT的荧光信号强度呈正相关。结论EphB3的表达可抑制胶质瘤的侵袭及迁移,其机制可能通过PI3K/AKT信号通路来影响肿瘤细胞的侵袭、迁移。

基于EphrinBs/EphBs通路探讨桃红四物汤治疗带状疱疹后遗神经痛大鼠模型的作用机制

目的观察桃红四物汤对带状疱疹后遗神经痛(PHN)大鼠模型的影响,探讨EphrinBs/EphBs通路在其中的作用机制。方法60只SD大鼠采用随机数字表法分为空白组、模型组(采用水痘-带状疱疹病毒慢性感染法构建PHN模型)、阳性组[建模后以普瑞巴林27 mg/(kg·d)灌胃]、治疗组[建模后以桃红四物汤5 g/(kg·d)灌胃],治疗+EphB2-Fc组[建模第3天鞘内注射EphB2-Fc 5μg后以桃红四物汤5 g/(kg·d)灌胃]和治疗+EphrinB2-Fc组[建模第3天鞘内注射EphrinB2-Fc 5μg后以桃红四物汤5 g/(kg·d)灌胃]。采用行为学法分别在给药后1 d、7 d和14 d时检测大鼠的机械痛阈值,酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测大鼠脊髓组织中白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子(TNF)-α水平,原位末端转移酶标记技术(TUNEL)法检测脊髓神经细胞凋亡,荧光法检测脊髓组织的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)活性,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测EphrinBs/EphBs通路相关蛋白EphrinB2和EphB2的表达。结果与空白组比较,建模后大鼠机械痛阈值明显降低,而大鼠脊髓中IL-1β、TNF-α水平、脊髓神经细胞凋亡指数、Caspase-3活性以及EphrinB2、EphB2蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);与模型组比较,给予桃红四物汤治疗的大鼠在给药后7 d和14 d时机械痛阈值均明显升高(P<0.05),而大鼠脊髓中IL-1β、TNF-α水平、脊髓神经细胞凋亡指数、Caspase-3活性以及EphrinB2、EphB2蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)。给予EphBs阻滞剂EphB2-Fc后大鼠脊髓组织中EphB2蛋白表达水平明显低于治疗组(P<0.05)。以EphBs激动剂EphrinB2-Fc作用后大鼠脊髓组织中EphrinB2蛋白表达水平明显低于治疗组,而EphB2蛋白表达水平明显高于治疗组(P<0.05)。结论桃红四物汤可能通过抑制EphrinBs/EphBs通路减少炎性因子的释放和脊髓神经细胞凋亡,对PHN大鼠发挥镇痛作用。

急性脑缺血通过激活EphB2/ephrin-B1/NMDA受体信号通路促进小鼠海马神经发生

目的:观察急性脑缺血对小鼠海马神经发生的影响,并探讨该过程是否涉及EphB2/ephrin-B1/NMDA受体信号通路的激活。方法:52只C57BL/6小鼠随机分为2组,即假手术组和急性脑缺血模型组,每组26只,其中每组用于Morris水迷宫实验6只,HE染色4只,BrdU免疫荧光染色4只,双皮质素(DCX)免疫荧光染色4只,RT-qPCR实验4只,Western blot实验4只。采用双侧颈总动脉夹闭法建立小鼠脑缺血模型。HE染色观察小鼠海马CA1区病理改变;Morris水迷宫实验检测小鼠学习与记忆等认知功能的改变;免疫荧光染色观察小鼠海马区BrdU阳性细胞和DCX蛋白表达以评估神经发生情况;RT-qPCR及Western blot检测小鼠海马EphB2、ephrin-B1、reelin、微管相关蛋白2(MAP-2)及NMDA受体亚基NR2A和NR2B的mRNA及蛋白表达。结果:脑缺血小鼠海马CA1区神经元损伤显著(P<0.01),学习记忆功能显著下降(P<0.01),提示脑缺血模型成功建立;海马区BrdU阳性细胞和DCX蛋白表达显著增加(P<0.01),表明脑缺血后海马出现神经发生;同时海马区EphB2、ephrin-B1、reelin、MAP-2、NR2A和NR2B的表达水平也显著上调(P<0.05)。结论:急性脑缺血能促进小鼠海马神经干细胞增殖及内源性神经发生,其促进神经发生的机制可能与激活EphB2/ephrin-B1/NMDA受体信号通路有关。

肿瘤细胞中酪氨酸激酶受体EphB4信号的多重生物学效应

Eph家族是酪氨酸激酶受体介导和调控生物学效应的重要成员，与其他酪氨酸激酶受体家族普遍具有促肿瘤生成作用不同的是，Eph受体具有肿瘤抑制功能。受体EphB4与其配体EphrinB2相互作用产生双重信号调控细胞黏附、迁移。人类大肠癌和胃肠道肿瘤中，EphB4表达缺失与肿瘤恶性程度增高相关。

EphB4/EphrinB2对血管生成的影响及中医药作用研究进展

血管相关性疾病已经成为危害人类健康的重大疾病之一,促血管新生和抗血管新生机制的研究也已成为中医药研究领域的热点问题。EphB4和EphrinB2均属于膜结合型蛋白,相对于其他酪氨酸激酶受体,EphB4和EphrinB2在自身活化和信号转导方面表现出独特的方式,在信号转导过程中二者均可被对方激活,产生"正向信号"和"反向信号"。已有研究发现,EphB4/EphrinB2独特的双向信号在血管生成过程中起着重要的双向调节作用,并且有可能成为中医药影响血管生长的新的研究方向。

浅谈EphrinB2/ephB4在骨重建中的作用

在颌骨骨重建研究中,破骨细胞骨与成骨细胞之间的相互作用中常伴有多种信号传导机制,最近,越来越多的学者发现Eph-Ephrin双向信号传导系统在骨重建中发挥重要作用。破骨细胞上存在EphrinB2配体,成骨细胞前体上存在EphB4受体,以细胞直接接触的方式,在成骨细胞内产生正向信号同时在破骨细胞内产生反向信号,从而起到抑制骨吸收促进骨形成的作用。本文就EphrinB2/ephB4在骨重建中的作用等研究进展作一综述。

调控EphB4/EphrinB2信号通路治疗绝经后骨质疏松症的研究进展

骨细胞骨吸收活性和成骨细胞骨生成活性相互调控,构成了一个独特的耦合关系,对骨质疏松病人的骨骼生长和保持其正常的骨组织形态具有重要意义。近年来,EphB4/EphrinB2通路被认为是调控骨质疏松发生发展的重要机制之一。现从中西医角度分析调控EphB4/EphrinB2信号通路治疗绝经后骨质疏松症的相关研究作一阐述,重点分析左归丸调控EphB4/EphrinB2信号通路治疗绝经后骨质疏松症的内在潜力。

EphB2受体N端结构域蛋白的纯化及其对胃癌细胞蛋白酪氨酸磷酸化的作用

EphB2受体在细胞生长、分化和信号转导过程中具有重要作用,为深入研究其在胃癌的信号转导中的作用及功能,检测了EphB2受体刺激胃癌细胞后的酪氨酸磷酸化的变化。利用Ni-NTA金属螯合亲和层析法将在E.coli中融合表达的重组蛋白EphB2受体的N端球状区进行纯化,并经Western印迹进行确证和ELISA方法检测该蛋白活性,得到纯度95％以上的融合蛋白,并有结合其天然配体的活性,EphB2受体诱导可以使胃癌细胞发生明显的蛋白质酪氨酸磷酸化的改变,即通过反向刺激其ephrinB配体引起了胃癌细胞信号转导通路中一些信号分子酪氨酸磷酸化的改变。

基于Wnt/β联蛋白信号通路探讨EphB2抑制剂对皮肤鳞状细胞癌的影响及作用机制

目的采用分子对接法筛选酪氨酸蛋白激酶受体B2(EphB2)小分子抑制剂, 研究其对皮肤鳞状细胞癌(CSCC)的影响及可能机制。方法利用Schrodinger对接工具预测EphB2蛋白的三维结构及其配体结合位点, 通过分子对接进行高通量虚拟筛选EphB2抑制剂, 通过体内外实验验证筛出的EphB2抑制剂山奈苷与芦荟大黄素(AE)抗CSCC的作用及机制。体外实验中, 将人CSCC细胞系A431、SCL^(-1)及人永生化表皮细胞HaCaT分别分为空白对照组、二甲基亚砜组、AE组与山奈苷组, 通过MTT实验(AE浓度:20、40、80、160 μmol/L;山奈苷浓度:12.5、25、50、100 μmol/L)、划痕实验及Transwell小室实验(AE浓度:80 μmol/L, 山奈苷浓度:50 μmol/L)分析EphB2抑制剂对CSCC细胞增殖、迁移、侵袭的影响。体内实验中, SPF级BALB/c雌性裸鼠皮下注射0.2 ml A431细胞悬液, 待成功长出瘤体以后, 随机分为4组(n = 6), 空白对照组、二甲基亚砜组、AE组(腹腔注射AE 20 mg·kg^(-1)·d^(-1) AE)与山奈苷组(腹腔注射山奈苷25 mg·kg^(-1)·d^(-1));每周测量裸鼠的肿瘤大小和体重;连续给药28 d后, 剥取裸鼠移植瘤进行HE染色, qRT-PCR与Western blot分析AE和山奈苷对裸鼠移植瘤中上皮钙黏着蛋白、波形蛋白、磷酸化葡萄糖合成激酶3β(p-GSK-3β)、β联蛋白及GSK-3β表达的影响。组间比较采用单因素方差分析及t检验。结果筛选出对EphB2具有较高抑制活性的两个小分子化合物AA-504/20999031(山奈苷)和AA-466/21162055(AE)。MTT实验结果表明, 与HaCaT细胞相比, AE对SCL^(-1)和A431细胞具有强烈的细胞毒性, 且随AE浓度升高毒性变强(F = 17.95, P<0.001), 作用48 h时, IC50分别为124.59 μmol/L和80.85 μmol/L;山奈苷对SCL^(-1)和A431细胞具有强烈的细胞毒性, 且随山奈苷浓度升高毒性变强(F = 11.34, P<0.001), 作用48 h时, IC50分别为119.64 μmol/L和64.96 μmol/L。划痕实验显示, 与二甲基亚砜组细胞迁移距离(88.1±1.4) μm相比, AE组和山奈苷组A431细胞迁移距离[(36.7±1.0) μm和(44.7 ± 3.5) μm]显著缩短(F = 52.34, P < 0.001), 而HaCaT细胞迁移距离差异无统计学意义(F = 1.73, P = 0.238)。Transwell小室实验表明, 与二甲基亚砜组A431细胞跨膜细胞数量(195.3 ± 5.7)相比, AE组和山奈苷组A431细胞显著抑制(145.0 ± 2.5和94.7 ± 4.1, F = 72.85, P < 0.001), 而对HaCaT细胞则无明显抑制作用(F = 3.91, P = 0.055)。动物实验表明, 与二甲基亚砜组裸鼠移植瘤体积(841.88 ± 84.63) mm3相比, AE组和山奈苷组显著下降[(407.42 ± 70.37) mm3与(368.77 ± 62.7) mm3, F = 73.78, P < 0.001]。HE染色证实, AE和山奈苷干预可改善其病理变化。qRT-PCR与Western印迹结果显示, AE和山奈苷明显上调瘤体组织中上皮钙黏着蛋白与p-GSK-3β mRNA和蛋白表达水平(均P < 0.001), 下调波形蛋白、β联蛋白及GSK-3β mRNA和蛋白表达水平(均P < 0.001)。结论分子对接筛选的小分子抑制剂与EphB2可形成稳定复合物, 并通过影响Wnt/β联蛋白通路诱导的上皮间质转化现象来抑制CSCC进程。

促红细胞生成素促进骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的:研究促红细胞生成素(EPO)通过ephrinB2/EphB4信号通路在细胞成骨分化中的作用。探讨EPO在骨稳态中的作用及其机制。方法:体外培养小鼠骨髓基质细胞系(ST2),加入EPO后,采用real-time PCR方法检测EphB4的表达以及成骨细胞相关基因的表达,采用ALP活性检测和茜素红染色观察EPO对成骨细胞功能的影响;在体外培养的ST2细胞中加入ephrinB2-Fc蛋白,模拟破骨细胞-成骨细胞共培养,使ephrinB-EphB4正向信号激活,采用上述方法检测其对成骨细胞的影响;进一步采用RNAi技术,使EphB4基因沉默,检测EPO对成骨细胞的影响。结果:EPO能增加ST2细胞RUNX2、ALP和Col1等成骨细胞相关基因的表达,同时伴随ST2细胞表面EphB4的表达升高,ALP活性和钙结节也增加;在模拟破骨细胞-成骨细胞共培养体系中,EPO也能促进ST2细胞的成骨向分化和功能;EphB4基因沉默后,EPO对ST2细胞的作用被减弱。结论:EPO能促进成骨细胞的分化和功能,该作用是通过ephrinB2/EphB4信号介导的。

BMP-2/bFGF双基因转染的骨髓间充质干细胞复合生物陶瓷骨促进兔桡骨缺损修复

目的探讨骨形态发生蛋白2(BMP-2)/碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)双基因转染的骨髓间充质干细胞(BMSC)复合生物陶瓷骨在兔桡骨缺损模型中的治疗作用,及其与EphB4/ephrin-B2信号通路的调控关系。方法体外分离培养兔BMSC并经流式细胞术鉴定,采用慢病毒载体将BMP-2/bFGF基因转染到兔BMSC,通过Western blotting鉴定过表达。制备BMSC复合生物陶瓷骨,植入兔挠骨缺损模型后,8周后取出缺损侧挠骨组织。HE染色观察桡骨组织形态变化;实时定量PCR检测成骨标志物Runt相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(ALP)、骨桥蛋白(OPN)和Ⅰ型胶原(ColⅠ)的表达;采用Lane-Sandhu组织学评分分析桡骨修复情况;采用免疫荧光检测桡骨组织ColⅠ、OPN的表达;采用Western blotting检测桡骨组织中EphB4、ephrin-B2水平。结果BMP-2/bFGF双基因转染的BMSC复合生物陶瓷骨能够改善缺损桡骨组织形态,提高桡骨组织Lane-Sandhu组织学评分,上调桡骨组织中Runx2、ALP、OPN和ColⅠ的表达,并能够上调缺损桡骨组织中EphB4和ephrin-B2的水平。结论BMP-2/b FGF双基因转染的BMSC复合生物陶瓷骨对兔桡骨缺损有修复作用,其机制可能与激活EphB4/ephrin-B2信号通路有关。

EphrinB2/EphB4在血管生长中的作用及中医药研究展望

近年来,有关ephrin及其Eph受体的作用研究已从神经系统方面逐步向血管生长扩展。已有研究表明ephrinB2/EphB4及其独特的双向信号转导几乎参与血管生长的每个方面,涉及血管发育过程中的动静脉分化、胚胎后血管新生包括内皮细胞增殖、迁移、粘附和分化等过程,且与VEGF、Notch等血管新生调控因子关系密切。另外,实验表明活血化瘀名方血府逐瘀汤显著的促血管新生作用与ephrinB2/EphB4相关,说明中医药促血管新生中ephrinB2/EphB4具有重要作用。本文部分总结了ephrinB2/EphB4在血管生长中的作用,并提出中医药在这方面的展望。

NP-9莫诺苷促进脑卒中后微循环网络重构作用

目的:脑卒中具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点,是严重危害人类生命健康一大疾病,虽然一直以来是临床及基础研究的热点,但目前除溶栓外仍缺乏有效的神经保护治疗手段。脑卒中后梗死周边区域微血管的数目的增多能有效改善区域微循环,改善患者神经功能。寻找促进梗死周边微循环网络重构的有效手段对脑卒中再生修复治疗有重大的意义。莫诺苷是我们课题组从中药山茱萸中提取的中药单体化合物,前期研究表明其具有抗炎、抗氧化、神经营养等特性,能够缩小脑梗死体积,改善神经功能,对于局灶性脑缺血大鼠预后有着积极的影响。本研究拟从多个水平系统评估莫诺苷对血脑屏障重构和微血管功能完整性的作用,并探讨微循环网络重构的可能机制。方法:选取体重在(260~280)g之间的SD雄性大鼠,线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞(Middle cerebral artery occlusion,MCAO)局灶性脑缺血再灌注模型。造模成功者随机分为假手术组、模型组、莫诺苷低剂量组(30 mg·kg-1)、莫诺苷中剂量组(90 mg·kg-1)和莫诺苷高剂量组(270 mg·kg-1)。激光散斑(PSI)进行皮层血流量监测。乳胶灌注取材检测血管数量。给药3天、7天、14天、28天后分别用灌注取脑和新鲜取脑的方式,收集实验标本,运用免疫组织化学法、免疫荧光法以及免疫印迹法检测血脑屏障通透性和血管新生相关指标。结果:①MCAO造模72 h后,大鼠患侧大脑EB染液渗透量增加,表明血脑屏障被破坏。而给予莫诺苷可通过下调梗死半暗带皮层MMP-9和MMP-2的表达,降低患侧皮层IL-1β的水平,进而抑制脑缺血早期血管的通透性。激光散斑仪对大鼠全脑皮层血流量监测结果表明:在缺血水平一致的情况下,莫诺苷给药显著促进大鼠缺血侧大脑血流恢复。乳胶灌注方法检测结果显示,莫诺苷给药能增加梗死侧大脑提供血供的血管数目,尤其有利于末端血管或小血管的生长。②MCAO造模7天后,大脑梗死周边区域,内皮祖细胞激活,血管芽生,特异性表达于芽生血管伪足上的p-FAK表达增加;同时脑缺血刺激引起促血管新生因子Ang-1及其受体Tie-2,以及NRP-1、FGF-2、VEGF等蛋白的表达升高。莫诺苷能进一步激活内皮祖细胞增殖,提高促血管生成因子的表达水平,增加皮层梗死半暗带血管数量,并将血管新生维持到28天。结论:以上结果表明,莫诺苷能减轻脑缺血早期血脑屏障损伤程度,并能够促进后期血管新生及微血管完整性修复,增加皮层梗死区域周边新生血管数量,改善脑卒中后微循环,为脑血管病的再生修复治疗提供基础。

基于阴阳平衡理论研究血管新生中的双向调控机制

血管新生是由已有的脉管系统发育出新的脉管的过程。血管新生与缺血性疾病、血管异常增生疾病密切相关,是当前研究的热点。血管新生是一个双向调节的过程,一方面血管新生依赖于促血管生成因子和抑制血管生成因子2种因子正负调控的精确平衡。另一方面,血管新生对缺血性疾病和血管异常增生疾病也起到正反两方面调控作用。阴阳学说是中医学基本理论之一,贯穿中医辨证施治的始终。血管新生的双向调控正如阴阳双方既对立又统一的关系以维持血管新生的平衡。肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、Notch信号通路、促红细胞生成素肝细胞激酶受体B4/促红细胞生成素肝细胞激酶受体配体B2(Eph B4/Ephrin B2)信号通路、转化生长因子-β(TGF-β)/Sma和Mad相关(Smad)信号通路等双向调控血管新生以维持血管新生的平衡,与阴阳平衡理论高度契合。