RNA干扰介导EphB4基因表达下调对胶质瘤细胞系U251生长的影响

目的:探讨靶向EphB4基因的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)对胶质瘤细胞EphB4 mRNA表达及细胞生长的影响。方法:体外化学合成针对人EphB4基因的小干扰RNA并转染恶性胶质瘤U251细胞系后,RT-PCR法检测EphB4 mRNA表达的变化,CCK-8检测法观察RNA干扰对肿瘤细胞增殖活性的影响,FCM检测细胞周期变化,划痕实验观察细胞的迁移能力,采用Transwell小室穿膜细胞的数量来反应细胞的侵袭能力。结果:U251细胞转染siRNA-EphB4 100nmol/L后,EphB4 mRNA的表达水平下降了75.0%,细胞增殖抑制表现为剂量依赖性,FCM检测与阴性对照相比,细胞周期不同程度阻滞于亚G1期;并且细胞的迁移能力与对照组比较有所下降,Transwell小室穿膜细胞与对照组比较明显减少。结论:siRNA-EphB4能够明显靶向并抑制U251细胞中EphB4基因的表达,而EphB4基因表达下调可使U251细胞增殖受到影响,细胞周期出现凋亡峰。转染siRNA-EphB4后U251细胞的迁移和侵袭能力受到不同程度的抑制。提示抑制EphB4基因表达有可能成为胶质瘤治疗的新方法。

喉鳞状细胞癌中EphB4基因突变与表达的研究

目的研究EphB4基因在喉鳞状细胞癌(喉癌)发生、发展中的生物学功能。方法应用RT-PCR和Westernblot的方法,以癌旁组织为参照检测EphB4基因在喉癌组织中的表达情况;应用差异聚合酶链反应(PCR)方法检测肿瘤组织中EphB4基因的扩增情况,聚合酶链反应-低离子浓度-单链构象多态性(PCR-LIS-SSCP)技术结合DNA测序筛查喉癌患者EphB4基因第13、14外显子的突变情况。结果EphB4基因mRNA和蛋白质在喉癌中的表达水平均明显高于癌旁组织(分别为0.738±0.137对0.450±0.173和0.757±0.174对0.509±0.168,均P<0.01),且EphB4基因的高表达与肿瘤的临床分期、分级、肿瘤的直径大小以及肿瘤的转移密切相关,40对配对样本中未检测出基因的扩增和突变。结论EphB4基因的过表达可能与喉癌的发生、发展有关,可能作为喉癌诊断和治疗的一个靶点。

EphB4和EphrinB2蛋白在视网膜母细胞瘤中的表达及其意义

目的探讨人视网膜母细胞瘤组织中Eph B4和Ephrin B2蛋白的表达水平及其临床意义。方法选取10例正常人视网膜组织(正常组)及47例视网膜母细胞瘤组织标本(病例组),采用免疫组化法检测两组Eph B4和Ephrin B2蛋白的表达水平,并分析二者的表达与视网膜母细胞瘤患者临床病理特征的关系。结果病例组Eph B4蛋白、Ephrin B2蛋白阳性表达率均显著高于正常组(P<0.01)。Eph B4与Ephrin B2蛋白在视网膜母细胞瘤组织标本的阳性表达均与临床分期、分化程度及视神经浸润显著相关:临床分期较晚、未分化型、视神经浸润者Eph B4与Ephrin B2蛋白阳性细胞比例高于临床分期较早、分化型及视神经未浸润者(P<0.05,P<0.01)。结论 Eph B4和Ephrin B2蛋白可作为视网膜母细胞瘤恶性程度及视神经浸润程度的预测指标。

EphB4、Beclin-1在稽留流产绒毛组织中的表达及与微血管密度的关系

目的分析探讨酪氨酸蛋白激酶受体(EphB4)、自噬基因(Beclin-1)在稽留流产绒毛组织中的表达及与微血管密度的相关性。方法收集2020年1月至2020年12月在南通大学附属医院妇产科确诊为稽留流产终止妊娠的患者62例为观察组,另选取同期正常早孕自愿终止妊娠患者60例为对照组;采用蛋白质印迹法检测两组绒毛组织中EphB4、Beclin-1蛋白的表达,采用免疫组化法检测两组绒毛组织中微血管密度(MVD),并分析EphB4、Beclin-1表达水平与MVD的相关性。结果观察组绒毛组织中EphB4蛋白相对表达量明显低于对照组(t=4.97,P<0.01);观察组绒毛组织中Beclin-1蛋白相对表达量高于对照组,差异有统计学意义(t=23.04,P<0.01);观察组绒毛组织中MVD明显低于对照组(t=12.42,P<0.01);在稽留流产患者绒毛组织中,EphB4蛋白相对表达量与MVD呈正相关(r=0.44,P<0.01),Beclin-1蛋白相对表达量与MVD呈负正相关(r=-0.52,P<0.01)。结论绒毛组织中EphB4、Beclin-1水平与稽留流产患者MVD有相关性,早孕期EphB4的低表达和Beclin-1水平高表达可导致血管生成障碍。

Ephb4启动子区域甲基化与肺腺癌的关系

目的研究肺腺癌患者外周血中Ephb4启动子区域甲基化状态，发现Ephb4甲基化与肺腺癌之间的关系。方法采用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测肺腺癌样本、及对照正常人血样本中Ephb4基因启动子区甲基化表型状态。结果证明Ephb4基因启动子区域在肺腺癌血样本中呈现高甲基化状态23．8％，正常人血样本中为O％。结论Ephb4基因启动子区域呈现高甲基化状态，表明Ephb4基因可能是肺腺癌的发生的早期事件，在肺腺癌的发生发展过程中起重要作用。

基因转染EphB4对脱落乳牙牙髓干细胞成骨分化的影响

目的:建立过表达EphB4的脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED),观察其成骨分化能力的变化。方法:使用酶消化法分离、培养SHED,将第3代SHED分为2组,即病毒介导的EphB4基因转染SHED的实验组和空白荧光载体转染SHED的对照组。通过荧光显微镜、实时荧光定量PCR(real time-PCR)检测转染后SHED细胞中EphB4 mRNA的表达水平,Western印迹法检测转染后EphB4蛋白的表达量。成骨诱导4周后,使用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)试剂盒及茜素红染色测定转染后SHED的ALP活性改变和成骨能力变化。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果:实时荧光定量PCR显示,实验组细胞中EphB4基因表达增高约8倍(P<0.05),Western印迹法显示,实验组细胞中EphB4蛋白表达较对照组显著增高。成骨诱导4周后,ALP检测结果表明,基因转染EphB4,可显著促进SHED的ALP活性(P<0.05),增高约2倍;茜素红染色显示,转染EphB4后,SHED成骨能力显著增强。结论:基因转染EphB4可显著促进SHED的成骨分化能力,为SHED成为骨组织工程中的种子细胞提供了依据。

慢性髓系白血病疾病进展相关基因的生物信息学分析与初步实验验证

本研究探讨慢性髓系白血病(CML)的疾病进展机制,为该疾病临床转归的评估及治疗选择提供新的分子标志物。从NCBI数据库GEO下载一组与CML疾病进展相关的基因芯片数据,利用生物信息学工具分析并得到与加速期(AP)和急变期(BC)相关的基因集,将这两组基因集进行信号通路分析和网络图谱分析得到与进展相关的关键基因和信号通路,并应用荧光定量PCR方法对其中的关键基因进行初步实验验证。结果表明,将AP相关基因和BC相关基因交叉比较,得到在AP和BC都有异常表达的9个基因;信号通路分析发现,整合素介导的细胞黏附,黏着斑细胞粘附以及细胞骨架调节在AP和BC始终发生异常;网络构建分析发现,关键节点的基因分别是MLLT4,WDR35和EPHB4。应用荧光定量PCR方法对疾病进展期和慢性期的患者进行比较发现,EPHB4在进展期的表达水平显著高于慢性期。结论:发现了与CML进展相关的9个基因,其中MLLT4,WDR35,EPHB4基因可能是导致CML进展的关键基因。

Ephb4基因多态性与非小细胞肺癌的关系

目前，人类功能基因组学及疾病基因组学已进入多基因疾病研究领域，而肿瘤被认为是多基因疾病，病因及发病机制尚不完全清楚。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列的多样性，是受到高度重视的新一代遗传标志，将构成今后基因组学研究的主要工具。

RNAi抑制人前列腺癌PC3细胞EphB4基因表达的实验研究

目的观察RNAi对人前列腺癌PC3细胞EphB4基因表达的抑制效应,寻求高效率的干扰片段。方法设计并化学合成特异性针对EphB4基因的siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)为实验组,另设一无意义siRNA为对照组,脂质体转染PC3细胞。荧光显微镜观察siRNA的转染效率;分别应用RT-PCR以及Western Blot、免疫荧光组织化学染色方法检测EphB4 mRNA和蛋白的表达,以及应用MTT法检测siRNA对PC3细胞生长的影响,比较实验组与对照组的差异及评估siRNA阻抑效应。结果实验组siRNA对PC3细胞EphB4 mRNA和蛋白的表达较对照组均有不同程度的下降,统计学分析其差异具有统计学意义(P<0.05)。siRNA对PC3细胞的生长具有抑制作用。结论RNAi可以有效地抑制人前列腺癌PC3细胞EphB4的表达,找到了具有较高抑制效率的siRNA,为进一步探究EphB4的生物学功能、体内实验和临床抗肿瘤药物研究打下基础。

甲基化抑制剂对CEM细胞EphB4基因表达及细胞增殖与凋亡的影响

目的探讨甲基化抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-CdR)对人急性淋巴细胞白血病细胞株CEM中抑癌基因EphB4的转录调控作用及对CEM细胞增殖凋亡的生物学影响,为寻找肿瘤治疗新靶点提供实验依据。方法采用亚硫酸氢盐修饰后测序法检测EphB4基因甲基化水平,荧光定量PCR法(Q-PCR)和Western blot方法检测5-aza-CdR处理前后EphB4基因mRNA及蛋白表达水平;MTS法检测不同剂量(1.0、2.5、5.0μmol/L)的5-aza-CdR作用于CEM细胞0 h、24 h、48 h、72 h、96 h对CEM细胞存活率的影响,流式细胞仪分析5-aza-CdR作用96 h对CEM细胞周期及凋亡的影响。结果 CEM细胞中存在EphB4基因的甲基化,甲基化水平为31.4%;不同浓度5-aza-CdR作用后CEM细胞甲基化水平均下降。5-aza-CdR作用使CEM细胞中EphB4基因的mRNA和蛋白表达上升;5-aza-CdR明显抑制CEM细胞增殖,并与药物浓度及作用时间呈正相关。5-aza-CdR处理96 h后,早期凋亡由4.1%上升为24.8%。用药96 h后,CEM细胞G1期由62.4%降至46.8%,G2期由2.1%升至16.2%,细胞阻滞于G2期。结论特异性甲基化转移酶抑制剂5-aza-CdR能使CEM细胞中沉默的EphB4基因重新表达,并可抑制白血病细胞增殖和诱导其凋亡。