表皮生长因子受体及Ⅲ型突变体在食管癌的表达及意义

背景与目的:已有研究显示表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ,EGFRv Ⅲ)在一系列恶性肿瘤的发生发展中起重要作用,但EGFR、EGFRvⅢ与食管癌的关系目前尚未明确。本研究探讨EGFR及EGFRvⅢ与食管癌组织发生发展的关系。方法:应用免疫组织化学及蛋白印迹实验(Western Blot)检测66例人食管癌组织及癌旁正常组织EGFR及EGFRvⅢ表达,评价EGFR及EGFRvⅢ在食管癌患者的性别、年龄、TNM分期及病理分级等临床参数组的表达分布。Pearson相关性检验分析EGFR及EGFRvⅢ表达相关性。结果:免疫组化显示EGFR、EGFRvⅢ在肿瘤组织表达的平均灰度净值分别为25.4±3.2、22.5±4.2,在癌旁正常食管组织平均灰度净值分别为5.0±3.5、5.5±3.0,肿瘤组织与正常组织相比差异均有显著性(P<0.000)。Western Blot显示EGFR、EGFRvⅢ在肿瘤组织表达的平均灰度净值分别为1.37±0.41、0.83±0.15,在瘤旁正常食管组织平均灰度净值分别为0.21±0.09、0.08±0.05,肿瘤组织与正常组织相比差异均有显著性(P<0.05)。在性别、年龄、肿瘤大小和生长方式方面EGFR、EGFRvⅢ的表达分布差异均无显著性(P>0.05),而在TNM分期、病理分级和淋巴结转移方面两者差异均有显著性(P<0.05)。免疫组化检测两蛋白表达净灰度值相关系数r为0.701(P<0.0001),Western Blot检测两种蛋白表达相关系数r为0.556(P=0.031)。两种研究方法均提示EGFR与EGFRvⅢ在食管癌中的表达成较好线性正相关性。结论:EGFRvⅢ在食管癌特异性表达,EGFR与EGFRvⅢ在食管癌中的表达呈线性正相关,提示EGFR与EGFRvⅢ与食管癌发生、发展密切相关。

人肾透明细胞癌中EGFRvⅢ的表达及意义

目的检测表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)在肾透明细胞癌组织中的表达,探讨其与肾透明细胞癌发生、发展的关系。方法采用免疫组织化学染色和图像分析法检测80例肾透明细胞癌和24例正常肾组织中EGFRvⅢ的表达水平,进行统计学分析、比较。结果肾透明细胞癌组织和正常肾组织EGFRvⅢ的表达阳性率分别为46%、8%。通过半定量分析,二者EGFRvⅢ平均灰度值分别为148.49±13.05和155.65±14.86,其差异具有统计学意义(t=2.13,P=0.04);男、女患者EGFRvⅢ的平均灰度值分别为149.01±13.70和147.40±11.76,二者无显著性差异(t=0.54,P=0.59);EGFRvⅢ表达与年龄无显著相关性(r=0.01,P=0.92)。结论EGFR-vIII在肾透明细胞癌组织中存在高表达,与肾透明细胞癌的发生、发展有一定关系。

靶向EGFRvⅢ包裹液态氟碳的高分子纳米球的制备及其体外靶向能力的评价

目的制备靶向表皮细胞生长因子受体突变体Ⅲ(EGFRvⅢ)并包裹液态氟碳高分子纳米球,评价其性质和体外靶向结合能力。方法采用Western Blot和流式细胞术验证抗EGFRvⅢ单克隆抗体(4G1)的特异性;双乳化溶剂挥发法制备包裹液态氟碳的高分子纳米球(P-NPs),光镜和扫描电镜观察其形态及分布;激光粒径仪检测其粒径及电位;碳二亚胺法耦联4G1制备P-NPs-4G1,流式细胞术观察二者连接情况;超声观察其体外经低强度聚焦超声(LIFU)致相变后的表现;流式细胞术和共聚焦显微镜检测P-NPs-4G1体外靶向结合能力。结果 P-NPs-4G1粒径为(563.8±60.3)nm,Zeta电位为(-32.4±3.37)mV;4G1与P-NPs的连接率为(97.37±1.57)%;P-NPs-4G1在体外经LIFU辐照后可增强其显像效果;体外靶向实验证实P-NPs-4G1可与F98__(npEGFRvⅢ)(EGFR-/EGFRvⅢ+)细胞特异性结合,且不与F98EGFR(EGFR+/EGFRvⅢ-)细胞结合。结论本研究成功制备P-NPs-4G1,经体外LIFU辐照后可显著增强超声显像效果,同时可与F98npEGFRvⅢ细胞特异性结合。

抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体噬菌体单链抗体库的构建与初步筛选

目的构建抗表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)特异性单链抗体库,从中筛选抗EGFRvⅢ特异性单链抗体。方法用pep-3偶联载体蛋白OVA,然后免疫BALB/c小鼠从脾淋巴细胞中提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增重链(VH)和轻链(VL)的可变区基因片段。将两基因片段由编码(Gly4Ser)3的linker连在一起,并克隆入噬菌体展示表达载体pCANTAB5E中,电转化至E.coliTG1,经辅助噬菌体超感染,构建噬菌体单链抗体库。以pep-3-BSA为抗原对所建抗体库进行4轮亲和筛选,用ELISA鉴定抗体与EGFRvⅢ结合的特异性。结果经琼脂糖凝胶电泳分析,RT-PCR方法扩增的抗体VH和VL基因片段大小约350和320bp,与预期理论值相符。经重组PCR得到大小约780bp的ScFv基因片段。ScFv基因片段经双酶切后成功定向克隆到噬菌粒载体,回收后构建成库容量为5.0×106的噬菌体抗体库,噬菌体滴度为3.0×104pfu/ml。通过亲和筛选使抗EGFRvⅢ噬菌体单链抗体得到富集,第4轮为第1轮的56倍。在E.coliHB2151中实现了单链抗体的可溶性表达。SDS-PAGE结果显示抗体相对分子质量为28000左右。ELISA测定结果显示该单链抗体具有结合EGFRvⅢ的特异性。结论成功构建了噬菌体单链抗体库,筛选得到了抗EGFRvⅢ特异性噬菌体单链抗体。

食管癌中EGFRvⅢ 、MMP-2的表达特点及意义

目的:探讨表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)及基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)在食管癌组织中的表达与食管癌发生、发展的关系。方法:收集66例人食管癌肿瘤组织,免疫组织化学及蛋白印迹实验检测EGFRvIII表达、免疫组织化学检测MMP-2表达,评价EGFRvIII、MMP-2在食管癌病人的性别、年龄、TNM分期、病理分级等临床参数组中的表达分布。Pearson相关性检验分析EGFRvIII与MMP-2表达相关性。结果:免疫组化显示EGFRvIII、MMP-2在肿瘤组织表达的平均灰度净值分别为22.46±4.21、37.46±6.18,在瘤旁正常食管组织平均灰度净值分别为5.54±3.01、9.80±2.24,肿瘤组织与正常组织相比均有显著的统计学差异(P<0.05)。Western-blot显示EGFRvIII在肿瘤和正常组织表达的平均灰度净值分别为0.83±0.15、0.083±0.049,两组相比具有显著的统计学差异(t=9.362,P<0.001)。EGFRvIII与MMP-2相关性系数r=0.766,P<0.001,成正性线性相关;在不同性别、年龄、肿瘤大小、生长方式组中EGFRvIII、MMP-2的表达分布均无统计学差异(P>0.05),而在不同TNM分期、病理分级和淋巴结转移中均有统计学差异(P<0.05)。结论:EGFRvIII在食管癌中特异性表达,MMP-2与EGFRvIII在食管癌中的表达呈显著线性正相关,提示MMP-2与EGFRvIII与肿瘤发生发展密切相关。

白藜芦醇对过表达EGFR的Ⅲ型突变体的胶质瘤细胞的生长抑制作用

目的:探讨白藜芦醇(resveratrol,Res)对过表达EGFR的Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的U87人脑胶质瘤细胞(U87-EGFRvⅢ)的生长抑制作用。方法:将不同浓度的Res作用于U87-EGFRvⅢ或U87细胞,用MTT法检测Res对细胞的生长抑制作用,流式细胞仪检测细胞凋亡作用,免疫印迹法检测Res作用后细胞内EGFRvⅢ的表达情况。结果:经不同浓度Res处理后的U87-EGFRvⅢ细胞和U87细胞均显示抑制细胞生长的作用(P<0.05);流式细胞仪显示不同浓度Res对U87-EGFRvⅢ有促凋亡作用,显著高于对照组(P<0.05),100μmol/L和200μmol/L Res的48 h的细胞凋亡率分别为20.1%±0.8%、46.9%±1.2%;免疫印迹法显示Res作用后U87-EGFRvⅢ细胞内的EGFRvⅢ的表达量显著下降。结论:Res可诱导U87-EGFRvⅢ细胞凋亡、抑制其细胞增殖,并可使细胞内的EGFRvⅢ表达下降。

CD133、EGFRvⅢ在人脑胶质瘤组织中的共表达及临床意义

目的探讨CD133、EGFRvⅢ在人脑胶质瘤组织中的共表达及临床意义。方法选择行手术治疗的脑胶质瘤患者40例,采用免疫组化双重染色法检测其脑胶质瘤组织中的CD133、EGFRvⅢ表达。结果 40例患者脑胶质瘤组织中的CD133+细胞、EGFRvⅢ+细胞阳性表达率分别为100%、40%,二者双染阳性表达率为35%。CD133呈棕黄色,位于细胞质和细胞膜上,多数阳性细胞在肿瘤组织中散在分布,部分呈聚集现象;EGFRvⅢ呈深蓝色,主要分布在细胞膜上,细胞质中有少量分布;在肿瘤组织靠近血管区两种阳性细胞存在共聚集现象。结论 CD133、EGFRvⅢ在脑胶质瘤组织中的分布具有相关性,在细胞水平上存在共表达,二者可以成为胶质瘤干细胞治疗的分子靶点。

人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定

目的构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定。方法应用PCR方法扩增EGFRvⅢ ECD片段,将其T-A克隆和测序,再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-vⅢECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上。Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别。结论成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究。

EGFRvⅢ单链抗体治疗小鼠脑胶质瘤的研究

目的探讨表皮生长因子受体III型突变体单链抗体(EGFRvIIIscFv)对小鼠脑胶质瘤的治疗效果。方法人工合成EGFRvIIIscFv基因序列并构建到原核表达载体中,诱导表达重组蛋白,经电泳和western blotting鉴定;再通过纯化和复性,得到有功能的EGFRvIIIscFv;用酶联免疫吸附分析(ELISA)测定抗体的亲和常数后,通过立体定向仪将其注射到胶质瘤小鼠的脑内,观察荷瘤鼠的生存期,免疫荧光法检测肿瘤血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果双酶切鉴定和测序结果证实人工合成的EGFRv Ⅲ scFv序列与基因数据库中完全一致;经过诱导表达,电泳显示重组蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达;western-blotting鉴定蛋白分子量为63kDa,与预期大小基本一致;该单链抗体亲和常数为0.203×10-8mol/L;将蛋白注射到荷瘤鼠的脑内,与对照组相比,实验组肿瘤VEGF表达量明显减少、荷瘤鼠中位生存期明显延长(P<0.01)。结论 EGFRvscFv重组蛋白可与EGFRvⅢ特异性结合;脑内注射EGFRvⅢscFv可明显降低胶质瘤血管形成,延长荷胶质瘤小鼠生存期。

人脑胶质瘤组织中EGFRvⅢ蛋白表达及其对细胞增殖的影响

目的探讨人脑胶质瘤组织中表皮因子受体突变体Ⅲ(EGFRvⅢ)蛋白的表达及对细胞增殖的影响。方法应用免疫组化法(IHC)和酶联免疫吸附法(ELISA),检测54例人脑胶质瘤患者胶质瘤组织、癌旁组织中EGFRvⅢ表达情况;通过向胶质瘤U87细胞株中转染EGFRvⅢ的siRNA和阴性对照(NC)的siRNA进行靶向抑制,测定EGFRvⅢ基因对胶质瘤U87细胞增殖的影响;通过建立高表达EGFRvⅢ的胶质瘤U87细胞株,测定EGFRvⅢ基因对胶质瘤U87细胞增殖影响。结果胶质瘤组织中EGFRvⅢ表达量、阳性细胞率、染色强度评分、IHC评分高于癌旁组织(P<0.05);EGFRvⅢ-siRNA组细胞在培养24~96 h的OD450nm值显著低于NC-siRNA组(P<0.05或P<0.01);U87-EGFRvⅢ细胞中的EGFRvⅢ的相对表达量为(0.73±0.19),显著高于U87-control细胞中EGFRvⅢ蛋白的相对表达量(0.09±0.01)(P<0.01);U87-EGFRvⅢ组肿瘤体积及肿瘤质量分别为(0.51±0.24)cm^3、(1.12±0.15)g,均显著大于U87-control组的(0.09±0.03)cm^3、(0.39±0.20)g(P<0.01)。结论 EGFRvⅢ在胶质瘤组织中表达量较高,且能诱导胶质瘤U87细胞的增殖,高表达的EGFRvⅢ可促进胶质瘤U87细胞的成瘤能力,通过靶向抑制EGFRvⅢ后可降低胶质瘤U87细胞的增殖能力,EGFRvⅢ与胶质瘤的发生、发展密切相关,为靶向治疗胶质瘤提供科学依据。

EGFR、EGFRvⅢ在肝细胞癌中的表达及意义

目的:探讨表皮生长因子受体(ep iderm a l grow th factor receptor,EGFR)、表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(ep iderm a lgrow th factor receptor varian t typeⅢ,EGFR vⅢ)与肝细胞癌(HCC)的关系。方法:应用免疫组化SP方法检测55例HCC及癌旁肝组织中EGFR和EGFR vⅢ的表达情况。结果:EGFR在HCC中的阳性表达率(58.18%,32/55)高于癌旁肝组织的阳性率(36.36%,20/55),两组差异有统计学意义(P<0.05)。EGFR vⅢ在HCC中的阳性率(61.82%,34/55)高于癌旁肝组织的阳性率(38.18%,21/55),两组差异有统计学意义(P<0.05)。EGFR蛋白在HCC组织中的检出率与临床分期、门静脉癌栓、肝外转移、术后复发相关(P<0.05),EGFR vⅢ蛋白在HCC组织中的检出率与临床分期、门静脉癌栓、肝外转移、术后复发、肿瘤大小相关(P<0.05)。结论:EGFR、EGFR vⅢ在HCC的发生、发展和转移中起重要作用,可作为预测HCC复发、转移的参考指标。

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体在卵巢癌中检测及靶向治疗的研究进展

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)作为最常见的表皮生长因子受体(EGFR)基因突变类型,只表达于恶性肿瘤,而不表达于正常组织中,是肿瘤特异性标志物,可作为卵巢癌靶向治疗的靶点。

抗EGFRvⅢ/EGFR单抗9B9的制备和鉴定

目的:制备抗EGFRvⅢ/EGFR单克隆抗体,并探讨其对人肝癌细胞株Huh7-EGFRvⅢ和表皮癌细胞系A431裸鼠移植瘤生长的抑制作用。方法:将稳转细胞株3T3-EGFRvⅢ免疫BALB/c小鼠,免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,ELISA法筛选出EGFRvⅢ阳性的克隆株并命名为9B9。Western blotting和免疫荧光鉴定9B9抗体与EGFRvⅢ/EGFR抗原结合的特性。建立裸鼠人肝细胞癌和表皮细胞癌移植瘤模型,分别腹腔注射PBS、西妥昔单抗和9B9抗体,比较它们对各移植瘤模型的抑瘤效果。结果:通过杂交瘤制备单克隆抗体技术筛选获得一株单抗9B9,Western blotting和免疫荧光结果显示其既能识别EGFRvⅢ又能识别EGFR。9B9抗体和西妥昔单抗对人肝癌细胞Huh7-EGFRvⅢ移植瘤的抑瘤率分别46%和42%,对人表皮细胞癌移植瘤的抑瘤率分别为86%和85%。结论:制备获得的单克隆抗体9B9可显著抑制裸鼠人肝细胞癌以及表皮细胞癌移植瘤的生长,具有与西妥昔单抗相似的抑瘤效果。

胶质母细胞瘤中EGFRv Ⅲ表达及对预后的影响

目的探讨表皮生长因子突变受体Ⅲ（epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ）在胶质母细胞瘤（glioblastoma,GB）中表达,研究影响患者预后的因素。方法收集2012-01至2013-12的98例GB患者,通过免疫组化染色观察EGFRvⅢ在组织标本中表达情况,以性别、年龄、肿瘤体积、生长部位及卡氏评分（Karnofsky Perfomance Scale,KPS）等临床参数作为研究因素进行统计学分析。结果 （1）免疫组化结果显示,EGFRvⅢ阳性表达率在GB病理标本和正常脑组织中分别为38.8%和0%。（2）单因素分析结果显示：EGFRvⅢ阳性组与阴性组中年龄、KPS评分差异有统计学意义（χ2=7.018,P=0.008;χ2=12.101,P=0.001）。（3）GB患者生存分析结果显示：EGFRvⅢ阴性组与阳性组的中位生存时间分别为13个月（95%CI,8.99~17.01）和12个月（95%CI,9.81~14.18）;在生存时间大于12个月患者中,EGFRvⅢ阴性组和阳性组的中位总生存时间分别为22个月（95%CI,16.91~27.09）和16个月（95%CI,14.04~17.95）;≥60岁和〈60岁两组,中位总生存时间分别为10个月（95%CI,6.73~13.27）和15个月（95%CI,11.90~18.10）。（4）Cox多因素分析KPS、EGFRvⅢ阳性表达是影响预后的独立相关因素。结论 EGFRvⅢ阳性表达、年龄和KPS评分是影响GB患者预后的危险因素。

肿瘤特异性嵌合抗原受体EGFRv Ⅲ-CAR的构建及体外活性分析

嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(chimeric antigen receptor-T,CAR-T),是通过体外激活和扩增肿瘤特异或非特异性杀伤细胞达到抗肿瘤效果,在肿瘤免疫治疗方面具有良好的应用前景。本研究构建靶向EGFRⅢ(epidermal growth factor receptor variant III)的嵌合抗原受体(CAR)的重组慢病毒表达载体,利用慢病毒感染并筛选能够稳定表达该嵌合抗原受体的Jurkat细胞系。通过EGFRvⅢ分子刺激、与U87MG细胞共培养的方式检测细胞系的活化状况。结果显示,成功构建了p CDH-EGFRvⅢsc Fv-CAR-cop GFP-T2A-puro慢病毒表达重组质粒,并筛选出可稳定表达EGFRⅢ-CAR的Jurkat细胞系。CCK-8法检测显示,EGFRvⅢ分子刺激12 h的Jurkat-CAR细胞增殖率约是对照组的1.36倍(P<0.05);ELISA法检测显示,与U87MG细胞共孵育后,细胞上清中IL-2的浓度约是单独培养分泌在上清中IL-2的1.625倍(P<0.01)。以上结果表明,稳定表达CAR的jurkat细胞,可以靶向性识别EGFRvⅢ分子及EGFRvⅢ阳性的靶细胞,并引起IL-2细胞因子释放,为后续临床细胞免疫治疗提供了理论基础。

EGFRvⅢ、MMP-2在子宫内膜癌中的表达及其临床意义

目的:探讨表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)在子宫内膜癌中的表达及其与子宫内膜癌的关系。方法:采用免疫组织化学检测96例子宫内膜癌患者的癌组织及癌旁组织中EGFRvⅢ和MMP-2的表达,分析EGFRvⅢ和MMP-2表达与患者临床分期、癌浸润和淋巴结转移的关系。Pearson检验分析EGFRvⅢ与MMP-2表达相关性。结果:EGFRvⅢ和MMP-2在子宫内膜癌组织中阳性率分别为81.3%和85.4%,高于癌旁组织的3.3%和8.3%,差异有统计学意义(P<0.05)。EGFRvⅢ和MMP-2的表达随临床分期升高、癌浸润和淋巴结转移的发生而增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。EGFRvⅢ的表达与MMP-2的表达呈正相关,相关系数0.723(P<0.05)。结论:EGFRvⅢ和MMP-2在子宫内膜癌组织呈高表达,其表达与子宫内膜癌发生、发展密切相关。

EGFRvⅢ与成胶质细胞瘤的免疫治疗

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)是EGFR最常见的突变体,在30%成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)中表达。EGFRvⅢ源于外显子2～7的缺失导致了受体的组成性激活,与肿瘤的发生、发展和不良预后密切相关。EGFRvⅢ独特的甘氨酸位点为靶向治疗提供了理想的分子靶点,针对EGFRvⅢ的免疫治疗策略在杀灭GBM细胞、抑制进展和侵袭等方面有着巨大的潜在价值,多肽/DC疫苗、治疗性抗体、小分子抑制剂、过继细胞免疫治疗等在实验室和临床都取得了令人鼓舞的结果,本文对EGFRvⅢ的特点及GBM免疫治疗的研究进展予以评述。

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体及血小板衍生生长因子-D在结肠癌组织中的表达及对靶向治疗的作用分析

目的探究表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)及血小板衍生生长因子-D(PDGF-D)在结肠癌组织中的表达及对靶向治疗的指导作用。方法选取2016年1月2017年6月于我院行结肠癌根治术的患者60例,收集其标本作为观察组,另取正常结肠组织20例作为对照组。采用免疫组织化学技术及蛋白质印迹法检测组织中的EGFRvⅢ和PDGF-D,比较结肠癌和正常结肠组织中上述2指标的表达差异及影响表达的因素。结果观察组EGFRvⅢ和PDGF-D的阳性表达率及含量均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。EGFRvⅢ和PDGF-D在结肠癌中的表达与性别和年龄无关,而同分化程度和临床病理分期(TNM)有关,分化程度低、TNM分期高的标本EGFRvⅢ和PDGF-D阳性表达程度及含量均高于分化程度高、TNM分期低的标本,差异均有统计学意义(P<0.05)。EGFRvⅢ和PDGF-D在结肠癌组织中的表达呈正相关(r=0.647,P<0.05)。结论 EGFRvⅢ和PDGF-D在结肠癌组织中表达显著增加,且同分化程度和TNM分期有关。

EGFRvⅢ在人脑成胶质细胞瘤中的表达及其对成胶质细胞瘤A172细胞增殖的影响

目的:探讨表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variantⅢ,EGFRvⅢ)在人脑成胶质细胞瘤中的表达及其对成胶质细胞瘤A172细胞增殖的影响。方法:应用免疫组织化学染色法检测EGFRvⅢ在60例人脑成胶质细胞瘤及其癌旁正常脑组织中的表达。建立稳定高表达EGFRvⅢ的成胶质细胞瘤A172细胞株,应用细胞计数法、MTT法、细胞克隆形成实验以及裸鼠成瘤实验检测其对成胶质细胞瘤A172细胞增殖的影响。结果:EGFRvⅢ在脑成胶质细胞瘤组织中的阳性表达率明显高于其癌旁正常脑组织(P<0.01);与转染空载体对照组比较,高表达EGFRvⅢ的A172细胞增殖能力明显增加;对照组和高表达EGFRvⅢ组的细胞克隆数分别为(50±10)个和(140±25)个,差异有统计学意义(P<0.01);高表达EGFRvⅢ组的裸鼠皮下移植瘤的体积和质量均高于对照组(P<0.01)。结论:EGFRvⅢ在人脑成胶质细胞瘤组织中高表达,并且可促进成胶质细胞瘤A172细胞的增殖。

抗EGFRvⅢ噬菌体抗体库的构建和筛选

目的:应用噬菌体展示技术筛选针对表皮生长因子受体突变体Ш(epidermal growth factorreceptor variant typeⅢ,EGFRvIII)的单链抗体(single chain Fv,scFv)。方法:利用原核表达纯化的人EGFRvIIIex蛋白和高表达EGFRvIIIex的小鼠成纤维细胞系NIH3T3免疫小鼠,扩增VH和VL片段并拼装成scFv基因,连接至噬菌粒pCANTAB5E,电击转化Hpd3cells,构建噬菌体单链抗体库,并进行3轮富集筛选。在第4轮筛选时,采用了降低抗原浓度的方法。然后将筛选得到的阳性克隆测序分析,转化E.coliHB2151,IPTG诱导可溶性scFv的表达。结果:构建了库容为7.9×107的噬菌体单链抗体库。经过第4轮低浓度抗原筛选,得到了较高亲和力的克隆。取单个阳性克隆测序分析结果表明,该抗EGFRvIII scFv基因序列长807bp,编码268个氨基酸。IPTG诱导后表达的可溶性scFv可分别与纯化的EGFRvⅢex抗原以及细胞表面的EGFRvⅢex结合。结论:利用噬菌体抗体库筛选得到了高亲和力的抗EGFRvⅢ scFv,为开发针对EGFRvⅢ的抗体药物提供了靶向载体分子。