一株牛蛙源虹彩病毒的分离及鉴定

用鲤鱼表皮瘤细胞系(epithelioma papulosum cyprini cell line,EPC)从福建省某美洲牛蛙养殖场分离到一株病毒FJ049。感染病毒的EPC呈现细胞圆缩、颗粒增多、脱落等特征性病变。间接免疫荧光检测结果表明,感染FJ049的EPC细胞与虹彩病毒单克隆抗体反应并出现特异性的胞浆荧光。采用PCR对虹彩病毒主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因保守区域进行扩增,扩增出531 bp的特异性基因片段。MCP基因同源性和遗传进化分析结果表明分离株FJ049与沼泽绿牛蛙虹彩病毒RGV9808的核苷酸同源性最高,为99.8%,属于虹彩病毒科蛙病毒属。

鲤鱼上皮细胞在不同培养条件下的生长状况及与哺乳动物细胞的比较

[目的]比较鲤鱼上皮细胞在不同培养条件下的生长状况。[方法]对不同培养基、温度、胰蛋白酶浓度、CO2培养条件下鲤鱼上皮细胞(EPC)的生长状况进行观察并进行指标测定。[结果]EPC细胞在培养基M199、温度20～25℃、胰蛋白酶浓度0.05%～0.10%条件下生长较好,对CO2的需求不大。[结论]该研究结果可为鲤鱼上皮细胞最优培养条件的筛选提供依据。

一株大口黑鲈(Micropterus salmoides)虹彩病毒(Iridoviridae)的分离及鉴定

2018年7月,浙江省某大口黑鲈(Micropterus salmoides)养殖场暴发疑似病毒引起的疾病。现场采样发现,病鱼体长约15-20cm,鱼体于水面下暗游,反应迟钝,体表有出血点或溃疡症状。本研究通过采用鲤鱼上皮瘤细胞(epithelioma papulosum cyprinid,EPC)培养、超薄切片透射电镜观察、病毒主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)克隆与测序分析等方法,从患病大口黑鲈中分离得到一株病毒,鉴定其属于虹彩病毒科蛙病毒属,命名为大口黑鲈虹彩病毒宁波分离株(LMBIV-NB001)。EPC经患病鱼组织匀浆液接种后出现细胞圆缩、死亡、脱落等典型的细胞病变症状。将感染后的EPC细胞制作超薄切片,通过电镜观察发现,EPC细胞质中存在大量直径约120nm具囊膜的正六边形成熟病毒粒子,形态与虹彩病毒相似。根据虹彩病毒MCP基因保守区域序列设计特异性引物对病鱼组织样本进行PCR扩增,获得了1029bp的目的基因片段。将该扩增片段连入pMD19-T simple质粒后测序,经BLAST比对分析显示,其与GenBank中已报道的鳜鱼蛙病毒NH-1609、大口黑鲈溃疡综合征病毒BG/TH/CU3、EPC060608-08的MCP基因同源性最高,相似度均达到99.13%。构建系统进化树分析表明,本研究分离的LMBIV-NB001株与NC_038508、GU256635、MG941005等虹彩病毒科蛙病毒属毒株聚成一簇。本论文研究结果为不同地区蛙病毒属成员的起源和分化等相关研究等提供了基础材料。

三种水生动物细胞系对两株蛙病毒敏感性的比较

利用3个不同物种的水生动物细胞系,包括爪蟾肾细胞系(A6)、大鲵胸腺细胞系(GSTC)和鲤上皮瘤细胞系(EPC),分别用沼泽绿牛蛙蛙病毒(RGV)和大鲵蛙病毒(ADRV)感染,进一步研究细胞病变显微形态、病毒滴度、细胞病变与不同感染时间的相关性等。结果显示,在光镜下可见感染病毒的细胞发生病变,A6和EPC细胞肿胀或破裂;GSTC细胞收缩或聚在一起形成多层。同种水产动物细胞系对不同蛙病毒的敏感性不同,在A6、EPC和GSTC细胞中,RGV的滴度分别为10^(3.6)、10^(5.9)和10^(6.6) TCID_(50)/m L;ADRV的滴度分别为10^(4.3)、10^(5.4)和10^(6.1) TCID_(50)/m L,表明GSTC细胞系对两种蛙病毒都更敏感。研究为后续蛙病毒致病机理提供了有用的信息和重要实验材料。

维生素C体外抑制SVCV入侵鲤鱼上皮瘤细胞的初步研究

为探究维生素C体外抑制鲤春病毒血症病毒(SVCV)侵染鲤鱼上皮瘤细胞(EPC)的能力,本试验构建了体外EPC模型,并运用MTT法、DAPI染色和活性氧测定等方法测定维生素C和SVCV对细胞活性的影响及维生素C对SVCV的抑制作用。结果显示,维生素C对SVCV体外侵染EPC具有显著的抑制作用(P<0.05),且与维生素C浓度呈正相关。本试验可为SVCV的防治提供新的途径。

大鲵蛙病毒诱导的鲤鱼上皮瘤细胞凋亡的研究

为研究大鲵蛙病毒(Chinese giant salam ander ranavirus,CGSRV)对细胞凋亡的影响,以CGSRV感染鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞,分别于感染后第0、3、6、9、12、15小时收集细胞,用倒置显微镜和透射电镜观察感染的EPC细胞的形态学变化,Annexin V-FITC/PI双染与JC-1染色后用流式细胞仪检测细胞凋亡率与线粒体膜电位(Δψm)崩解率。结果显示,EPC细胞在感染后第6小时出现细胞收缩变圆,脱落,漂浮于培养基中;电镜下,被感染的EPC细胞的细胞核出现典型的染色质边集呈月牙形和染色质浓缩形成凋亡小体的现象。流式细胞仪检测结果显示,感染后第3小时即出现凋亡率和线粒体膜电位崩解率显著上升,6 h后实验组各时间点凋亡率和线粒体膜电位崩解率都极显著地高于对照组(P<0.01)。结果表明,CGSRV感染EPC细胞可通过线粒体途径诱导EPC细胞凋亡。