Epstein-Barr病毒潜伏蛋白1通过核转录因子κB诱导鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性

利用已建立的原代人胚鼻咽上皮细胞和Tet on LMP1系统等良好的实验模型 ,采用荧光酶报道基因分析法和端粒酶TRAP ELISA技术 ,分别检测EB病毒潜伏蛋白 1(LMP1)诱导的核转录因子κB (NFκB)活性和端粒酶活性 ,从LMP1介导NFκB信号传导途径角度 ,探讨LMP1诱导端粒酶表达的分子机制 .结果表明 ,LMP1可诱导鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性 ,将LMP1羧基端胞浆区突变后 ,可同时下调NFκB活性和端粒酶活性 .在Doxycycline诱导LMP1表达状态下 ,NFκB反式激活活性增强 ,同时端粒酶活性升高 ;进一步应用硫代磷酸化修饰的反义NFκBp6 5寡脱氧核苷酸和IκBα的显性负性突变体分别阻断NFκB活性 ,可降低由LMP1诱导的端粒酶活性 .因此 ,NFκB作为LMP1信号传导途径上的枢纽 ,可能介导了LMP1对端粒酶的表达调控 .

应用重组猪生殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白为抗原建立I-ELISA检测方法的研究

用重组杆状病毒表达的猪生殖和呼吸综合征病毒 (PRRSV)N蛋白作为抗原 ,建立了诊断猪生殖和呼吸综合征(PRRS)的I ELISA ,与IDEXX公司试剂盒检测结果的符合率为 97.3 % ,与间接荧光抗体试验 (IFA )的符合率为 10 0 %。用该方法检测国内猪血清 85份 ,阳性率为 18.8% ;能检出PRRS疫苗免疫猪 6d的血清抗体 ;与猪瘟、伪狂犬病、猪巴氏杆菌病、猪霉形体病阳性血清无交叉反应。

人冠状病毒SARS-CoV、229E和OC43核衣壳(N)蛋白单克隆抗体的制备及3株人冠状病毒N蛋白的抗原相关性观察

目的通过制备和鉴定人冠状病毒SARS-CoV、229E和OC43核衣壳(N)蛋白单克隆抗体(mAb),观察3株人冠状病毒的N蛋白抗原相关性。方法分别用基因重组SARS-CoV、229E和OC43N蛋白免疫BALB/c小鼠,制备mAb,并采用ELISA间接法、免疫印迹和免疫荧光进行筛选和鉴定,同时用mAb分析3株人冠状病毒N蛋白之间的免疫交叉反应。结果获得多株抗SARS-CoV、229E和OC43 N蛋白mAb杂交瘤细胞株,ELISA间接法、免疫印迹和免疫荧光结果均显示,所有的mAb仅与各自病毒的N蛋白特异性反应,而在3株人冠状病毒N蛋白抗原之间不产生免疫交叉反应。结论获得的特异性抗人冠状病毒N蛋白mAb为进一步研究3株人冠状病毒的抗原决定簇相关性奠定了基础。

Epstein—Barr病毒核抗原的研究进展

Epstein—Barr病毒(EBV)是引起传染性单核细胞增多症(IM)的病原体,且与Burkitt淋巴瘤(BL)和鼻咽癌(NPC)具有密切关系。EBV感染人类B淋巴细胞后引起细胞转化,其基因组整合于宿主细胞DNA或以附加体的形式存在,多数表现为潜伏感染。迄今,在EBV感染或转化的细胞中已发现多种EBV特异性抗原:壳抗原(VCA),膜抗原(MA)。

泛素与EB病毒核抗原1融合基因的DNA免疫研究

构建了EB病毒核抗原1(EBNA1)基因的表达质粒pCI-EBNA1和泛素(ubiquitin,Ub)与EBNA1融合基因的表达质粒pCI-Ub-EBNA1。间接免疫荧光和Westernblot分析表明,两重组质粒转染HeLa细胞后均能瞬时表达。两种质粒DNA肌肉注射免疫Balb/C小鼠后,分别检测小鼠血清抗EBNA1的抗体和特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,比较单基因与融合基因DNA免疫所诱生免疫应答的强度。结果显示:二者诱生抗体的效率无明显差别,但泛素的融合使得针对EBNA1的特异性CTL反应明显增强。

用免疫金颗粒标记鉴定舞毒蛾核型多角体病毒的抗原

用免疫电镜金颗粒标记技术准确、快速地对舞毒蛾(Lymantria dispar)核型多角体病毒抗原进行了定位和鉴定。舞毒娥病毒的多克隆抗体与同源的多角体抗原之间存在着强烈的亲和性,但与不同源的松柏锯角叶蜂(Neodiprion sertifer)病毒多角体抗原仅有极微弱的交叉反应。舞毒蛾病毒粒子和核衣壳抗原也能与同源的多克隆抗体作用。在被病毒感染的舞毒蛾脂肪体细胞核中,成熟的多角体被金颗粒重重标记,其外缘的游离病毒粒子和核衣壳亦被标记,但亲和力较弱。在被感染的脂肪体细胞核和质内发现一种与多角体蛋白晶体不同源的菱形结晶体。

EB病毒核抗原1羧基端的原核表达、纯化及其免疫学特性

为进一步研究EB病毒核抗原 1(EBNA1)的功能及提高EB病毒 (EBV)相关疾病辅助诊断的特异性 ,对EBNA1基因 3′端的部分片段进行了原核表达、纯化并初步研究其免疫学特性 .采用PCR法扩增了EBNA1基因编码区 ,经酶切鉴定、序列分析后 ,将其 3′端 5 73bp片段克隆至原核表达载体pET30a中 ,得到重组质粒pET30a SS5 80 .该重组质粒转化大肠杆菌BL2 1(DE3)感受态细胞并经异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达出分子量约 2 5kD的融合蛋白 (2 5 kDEBNA1) .该蛋白以包涵体和可溶形式存在 ,均可用Ni2 + 离子亲和柱纯化 .Western印迹结果显示 ,该蛋白能与鼻咽癌 (NPC)病人血清发生特异性反应 .纯化的 2 5kDEBNA1蛋白免疫BALB c小鼠后 ,经ELISA检测获得了高效价的多克隆抗体 .免疫印迹和间接免疫荧光结果显示制备的免疫小鼠血清能够与HeLa细胞中瞬时表达的EBNA1蛋白发生特异性反应 ,且特异性优于鼻咽癌病人血清 .以上结果表明成功构建了EBNA1羧基端的原核表达质粒 ,并在大肠杆菌中高效表达了 2 5kDEBNA1蛋白 。

SASR-CoV核衣壳蛋白在杆状病毒-昆虫系统的克隆表达及抗原性分析

目的:SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)在杆状病毒-昆虫系统的表达,研究其抗原性。方法:利用PCR方法扩增SARS-NP全长基因,使用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶定向插入Bac-to-Bac系统的pFastBac HTC载体,构建重组质粒转化DH10Bac细胞,获得重组杆粒DNA后转染Sf9细胞,在High Five细胞中表达SARS-NP;表达产物经NiNTA亲和层析纯化及免疫印迹和ELISA方法验证抗原性。结果:成功构建pFastBac HTC-SARS-NP重组质粒,并在High Five细胞高效表达,获得相对分子量约48 kD的重组蛋白质。经验证,重组蛋白能被SARS-CoV NP的特异性单抗(8E1A17)和兔免疫血清识别,能与SARS患者血清反应,与健康人血清、人冠状病毒229E型和OC43型的杂交瘤培养上清、相对应的兔免疫血清、患者血清均无交叉反应,具良好抗原反应性。结论:SARS-NP成功表达于杆状病毒-昆虫系统,具较强抗原反应性,初步认为其与229E型和OC43型感染血清无交叉反应性。

鼻咽癌血清中EB病毒核抗原-1和核抗原-2抗体的研究

用抗补体免疫荧光法检测鼻咽癌患者和对照人群中EB病毒核抗原-1(EBNA-1)和EB病毒核抗原-2(EBNA-2)抗体的水平。鼻咽癌组中两种抗体滴度都升高,以EBNA-1抗体上升明显;且EBNA-1抗体与总EBNA抗体水平的变化趋势相一致。鼻咽增生性病变组中EBNA-2抗体略占优势,该组中EBNA-2抗体水平升高可能与潜伏状态的EB病毒激活或再感染的早期阶段有关。

卡波济肉瘤相关疱疹病毒潜伏相关核抗原编码基因的克隆及表达

目的:分离卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)潜伏相关核心抗原(LANA)羧基端基因(ORF73C),并在大肠杆菌中克隆和表达。方法:设计一对PCR引物,在引物的5′端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点,提取稳定状态的BCBL-1细胞的总DNA作模板,通过PCR扩增KSHV ORF73C,PCR产物经双酶切后按正确的读码框克隆进原核表达质粒pGEX-6p-1中,并转化大肠杆菌感受态细胞BL21,以异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达融合蛋白。结果:经核酸序列测定及分析,分离、克隆的ORF73C基因与基因数据库中登记的ORF73基因的羧基端的621bp的序列有99％同源性。经IPTG诱导的重组质粒转化菌体SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳显示有大小约为46ku的融合蛋白表达。结论:初步表明ORF73C基因在大肠杆菌中获得正确表达。

EB病毒核抗原3C提高Gemin3基因的表达

目的探讨EB病毒核抗原(EBNA)3C对Gemin3基因表达的影响。方法共转染EBNA3C和Gemin3基因至HEK293细胞。依靠慢病毒载体介导发卡RNA干涉敲减EBNA3C基因的表达,并经嘌呤霉素筛选获得稳定的EBNA3C低表达细胞系,采用Western blot检测EBNA3C对Gemin3蛋白表达的影响。结果 Gemin3基因的表达随着EBNA3C表达量的增加而增加,呈剂量依赖性,在EBNA3C基因敲减细胞中Gemin3的表达减少。结论 EBNA3C可提高Gemin3基因表达水平。

V-val突变型EB病毒核抗原1的功能研究

背景与目的:EB病毒核抗原1(Epstein-Barr viral nuclear antigen 1,EBNA 1)对于维持EB病毒的潜伏感染有重要作用。V-val变异型的EBNA1与鼻咽癌有密切的相关性。本研究旨在比较原型和V-val变异型的EBNA1基因在上皮细胞中的功能的差异。方法:用PCR方法扩增出原型和V-val变异型EBNA1基因的全长并克隆到pGFP载体上,转染HEK293细胞,检测两种亚型的EBNA1蛋白的表达对细胞生物学性状的影响。以含有EB病毒增强子FR序列的荧光素酶载体作为报告基因,比较两种亚型的EBNA1基因对质粒的转录激活能力。结果:原型和V-val变异型EBNA1基因的表达对HEK293细胞的生长速度没有明显影响,但表达原型EBNA1的细胞的克隆形成能力明显低于V-val亚型。在裸鼠致瘤实验中,接种表达原型和V-val变异型EBNA1细胞的实验组均未见肿瘤形成。但是在瞬时转染实验中,表达V-val变异型EBNA1基因的HEK293细胞的荧光素酶活性明显高于原型EBNA1基因。结论:原型和变异型EBNA1均未发现有明显的转化细胞的能力,但是V-val变异型EBNA1蛋白与原型相比,其转录激活的功能明显增强。

多胺对Raji细胞中Epstein-Barr病毒早期抗原的诱导

[目的]探讨精胺和亚精胺对EB病毒抗原的诱导作用。[方法]分别利用细胞计数法和免疫酶法对Raji细胞进行活细胞计数和500个细胞中有Epstein鄄Barr病毒早期抗原的表达细胞数。[结果]精胺和亚精胺的半数致死量分别为970.4094ng/ml和87.71987ng/ml;精胺和亚精胺单独诱导EB早期抗原表达率分别为4.6%和4.2%;而精胺、亚精胺与正丁酸协同作用时,其早期抗原表达率分别达到20.6%、21.6%。[结论]精胺和亚精胺可诱导Raji细胞内Epstein鄄Barr病毒早期抗原的表达,当它们分别与正丁酸协同作用时,其表达率增高。

应用人脐带血单个核细胞体外同时表达EB病毒和巨细胞病毒蛋白抗原

目的：拟建立一种能预防和治疗移植后病毒感染的抗原呈递细胞（ antigen presenting cell,APC）。方法：利用人的脐带血单个核细胞（ CB derived mononuclear cells, CBMC），用 EB病毒 (Epstein Barr virus, EBV)感染转化成 B淋巴母细胞细胞系（ B lymphoblastoid cell lines, BLCL），再用编码有 CMV.pp65蛋白基因的逆转录病毒转染，最后经 Western blot和免疫组化检测，证实该株细胞同时表达 EBV和巨细胞病毒 (cytomegalovirus, CMV)特异性蛋白。结果：获得了能同时表达 EBV和 CMV特异性蛋白的细胞株。结论：上述方法可以建立能同时表达 EBV和 CMV特异性蛋白抗原的细胞系。

狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内的质控方法

目的探讨狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控方法。方法以ELISA双抗体夹心法检测狂犬病病毒抗原为例,采用“Levey-Jennings”和“即刻法”质控法进行对比。结果“Levey-Jennings”质控图中所有测定结果均处于“在控状态”,而“即刻法”质控图中一次测定结果处于“失控状态”。结论宜采用双质控方法进行狂犬病病毒核衣壳抗原诊断试剂盒实验室内质控。

宫颈癌人类乳头状瘤病毒16/18型感染及增殖细胞核抗原表达的意义

宫颈癌是最常见的女性恶性肿瘤之一，近年来发病率有升高趋势。宫颈人类乳头状瘤病毒（human papillomavirus。HPV）感染是宫颈癌的主要危险因素，高达90％以上的患者伴有HPV感染。HPV16型、18型的感染与宫颈鳞癌直接相关，在83．3％f10宫颈鳞癌组织中，可检测到HPV16、HPV18的DNA。

丙型肝炎病毒核壳蛋白抗原的化学合成及其在病毒学诊断中的应用

丙型肝炎病毒(HCV)是单股正链RNA病毒,1991年正式归人黄病毒科丙型肝炎病毒属国内外的流行病学研究表明,大约90%的输血后肝炎均由HCV引起,而HCV的慢性感染者则为原发性肝细胞癌的高危人群另据调查,在我国的肝病患者以及某些采血点的供血员特别是单采血浆献血员当中,HCV感染十分严重.因此,丙型肝炎的防治是我国的重大卫生保健问题,而在目前,HCV诊断试剂的研制又是丙型肝炎防治研究的首要课题. 美国Chiron公司首先利用HCV基因组的C-100区段(估计编码NS3/NS4蛋白)在酵母细胞中表达融合蛋白,制成第一代的HCV诊断试剂,可检出约70%的HCV感染者.随着越来越多的HCV基因组全序列得到阐明,HCV核壳蛋白在病毒学诊断中的作用也受到广泛注意.

系统性红斑狼疮患者抗Sm抗体与EB病毒核抗原-2表达的相关分析

目的探讨EB病毒(EBV)阳性系统性红斑狼疮(SLE)患者EBV核抗原-2(EBNA2)表达与抗Sm抗体的相关性。方法SLE患者44例,正常人43名作为对照。①采用PCR-Southern杂交技术检测两组外周血单个核细胞中EBV特异性DNA片段,EBV阳性患者进行RT-PCR和Southern杂交检测EBNA2的表达。②ELISA法检测EBV特异性IgM抗体。③免疫印迹法检测血清可提取核抗原(ENA)抗体。结果①SLE组32例EBV阳性,其中EBNA2mRNA阳性20例(活动期9例,稳定期11例),EBNA2mRNA阳性率在活动期和稳定期患者差异无显著性(P>0.05)。②SLE组EBV特异性IgM抗体阳性率为18.18%(8/44),对照组均为阴性,两组有显著性差异(P<0.05)。③SLE抗Sm抗体检出率与EBNA2 mRNA检出率呈正相关(r=0.4107,P<0.05)。结论EBNA2 mRNA表达可能在一定程度上参与SLE的发病和病情进展。

EB病毒核抗原1羧基端原核表达产物的纯化方法

EB病毒核抗原 1羧基端的原核表达产物以包涵体和可溶性两种形式存在,用镍离子亲和柱分别对其进行了纯化。结果显示,可溶性部分以及经 2M尿素溶解后的包涵体的最适咪唑洗脱浓度均为 150mM。纯化后重组蛋白的纯度在 90%以上。

EB病毒诱发淋巴瘤中EB病毒核抗原-1的表达

目的:检测EB病毒(EBV)诱导正常人淋巴细胞发生肿瘤前后EB病毒核抗原-1(EBNA-1)的差异表达情况,为研究EBV诱发淋巴瘤的发生机制提供实验依据。方法:构建SCID小鼠体内EBV诱发淋巴瘤的动物模型,分别采用实时定量PCR和Western blot方法检测EBNA-1基因的表达情况。结果:成功复制EBV诱发淋巴瘤动物模型,EBNA-1基因在6例"正常人"淋巴细胞和3例诱发淋巴瘤细胞中均有表达,在诱发淋巴瘤细胞中的表达比在正常人淋巴细胞中的表达上调11 683倍,差异有统计学意义。Western blot结果显示,与正常人淋巴细胞组相比,EBNA-1在诱发淋巴瘤细胞的蛋白表达明显升高。结论:EBV诱发淋巴瘤中EBNA-1的表达上调,EBNA-1在EB病毒诱发淋巴瘤的形成过程中可能起重要作用。