Bal31删除法测定马传染性贫血病病毒表面抗原基因的核苷酸序列

关于大片段DNA序列测定的策略,文献报道者已为数不少。本文作者在研究马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)表面抗原基因(cDNA)变异性时,曾用鸟枪法获得了原病毒及变异病毒基因的核苷酸序列(共2.9kb)。但是,在该法测序过程中,95％的序列资料在较短时间内即可获,得而所剩5％的序列资料却需化费较长时间才能得到。为了克服这一不足,我们又采用了Bal31删除法稍加修改的策略。

马传染性贫血病毒囊膜基因的研究进展

马传染性贫血病毒是反转录病毒科慢病毒属的成员之一 ,不仅与人免疫缺陷病毒具有序列同源性 ,而且与其血清具有交叉反应。马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗是迄今为止唯一研究成功的慢病毒疫苗。在马传贫病毒囊膜基因的研究中有助于弄清其抗原变异、持续感染和疫苗免疫机理 ,为艾滋病疫苗的研究提供借鉴。对囊膜基因的结构、变异及其在机体免疫应答中的作用进行了讨论。

马传染性贫血病毒env gp90基因在实验感染马体内的遗传变异(英文)

为确定马传染性贫血病毒（ＥＩＡＶ）ｅｎｖｇｐ９０基因的遗传变异特性，本研究应用ＥＩＡＶ日本分离强毒株Ｐ３３７－Ｖ７０实验感染了１匹健康马，经第２次感染后，实验马未呈现临床症状。ｇｐ９０基因的核苷酸序列被直接从这匹马的外周血和肝脏所获得的前病毒ＤＮＡ扩增。通过克隆和测序从这匹马获得了覆盖ＥＩＡＶｇｐ９０基因主要中和抗原功能区（ＰＮＤ）的１７个前病毒序列。通过对这些序列的比较分析，发现一些序列在ＰＮＤ功能区含有核苷酸的插入变异。为揭示ＰＮＤ基因中插入基因片段的产生原因，应用计算机软件对这些片段可能的复制和片段的移位进行了推测。结果显示，这些不同长度的基因插入片段可能是由于其ＰＮＤ基因序列片段的直接重复和移位所产生。鉴于本研究所作序列分析的ＥＩＡＶ变异株是从感染马组织直接获得的，而ＥＩＡＶ的基因组结构在慢病毒中较为简单，故可作为感染模型用于慢病毒持续感染机理的研究。

马传染性贫血病毒弱毒疫苗S2基因在体内变异分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)驴白细胞弱毒疫苗EIAVDLV121的S2基因在马体内的变异规律,本研究选用4匹成年马,其中2匹(#1、#2)接种EIAVDLV121,另外2匹作为对照。免疫后监测马体温、血小板含量以及病毒载量结果显示,免疫马未出现马传染性贫血体征。通过RT-PCR方法检测病毒S2基因在感染马体内不同时期的基因序列,结果显示,免疫马体内EIAVDLV121 S2蛋白的突变主要发生在氨基酸第17位、22位、39位、41位、51位和55位。另外,#1马免疫后70 d以及#2马免疫后第14 d和第28 d检测疫苗毒S2蛋白序列与EIAVDLV121亲缘关系较近,而#1马免疫后第42 d、第112 d和第140 d的疫苗毒S2蛋白序列与EIAVDLV121的致病性亲本强毒株EIAVLN40亲缘关系最近。本研究结果有助于对EIAV及EIAV疫苗株在马体内感染进程的研究。

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株囊膜基因的优化及其DNA疫苗体外瞬时表达研究

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus,EIAV)的密码子使用频率与哺乳动物间存在着明显差异。为此,对马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株(DLA-EIAV)囊膜全长基因按照哺乳动物优势密码子的使用原则进行了重新设计和合成,并以此为基础通过重叠延伸PCR、限制酶切等方法得到结合型和分泌型囊膜基因,将其插入含有鸡beta-actin/兔beta-globin复合启动子(AG)的高效表达载体pCAGGS中,构建了EIAV驴白细胞弱毒疫苗株结合型和分泌型囊膜基因的DNA疫苗质粒pCAGGS-opti-bou-env、pCAGGS- opti-sec-env。将构建的质粒纯化后分别转染293T细胞,以间接免疫荧光和Western blot方法检测转染48 h后细胞及上清中囊膜蛋白的表达。结果显示,两种表达质粒均可正确表达EIAV囊膜蛋白,与相对应未优化的表达载体pCAGGS-wt-bou-env和pCAGGS-wt-sec—env相比,密码子优化的基因体外瞬时表达水平有极为显著的提高,而且蛋白表达部位也与预期的结果符合。这一结果为EIAV囊膜蛋白的单抗制备、表位鉴定、免疫试验、新疫苗的开发等奠定了基础。

马传染性贫血病毒在慢性感染体内的抗原变异

应用在日本分离的马传染性贫血病毒 (EIAV)强毒株P337 V70实验感染了 1匹健康马 ,经 2次感染后 ,这匹实验感染马并未呈现临床症状。从这匹马的外周和肝组织获得了覆盖马传染性贫血病毒gp90基因主要中和抗原功能区 (PND)的前病毒序列。通过对这些序列的比较分析发现 。

马传染性贫血病毒强毒株gag和gp45基因的体内进化分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株体内进化规律,将3匹马分别以1×105 TCID50/匹接种EIAVLN40强毒株后,在不同时间点采取外周血,分离单核白细胞。提取白细胞中的DNA,并以其为模板,应用套式PCR技术分别扩增EIAV前病毒DNA的p15,p9和gp45基因,经克隆后进行序列分析。结果显示,与接种前EIAVLN40相比较,p15基因核苷酸和氨基酸平均差异率分别为1.8%(0～2.9%)和1.7%(0～3.6%);p9分别为2.5%(0.3%～3.8%)和2.9%(0～4.8%);gp45-Ⅰ分别为1.3%(0.3%～2.1%)和1.8%(0～3.2%),gp45-Ⅱ分别为2.1%(0～3.4%)和2.6%(0～4.7%)。在EIA发热期,每个基因核苷酸和氨基酸差异率最小;在亚临床阶段,每个基因平均差异率总体上相对较高。氨基酸变异位点分析发现,发病期(2-2、3-1)各基因氨基酸序列回复到亲本株EIAVLN40,其余时期p15基因氨基酸稳定变异位点16N/S、88T/S和112M/E;p9基因115E/G和122K/M;gp45-Ⅰ基因9T/F/L;gp45-Ⅱ基因21E/K和29G/S。此外,p15基因进化树结果显示,发热期(2-2、3-1)p15基因序列与EIAVLN40序列处于同一分支上,亚临床阶段大多数p15基因序列处于另一个大分支上;其他基因进化情况与p15基因类似。对EIAV p15、p9、gp45基因体内进化分析,有助于对EIAV在马体内感染进程的研究,为进一步研究EIAV持续感染和逃避免疫监视的机制提供参考。

马传染性贫血病毒囊膜蛋白GP90的表达及其免疫效果研究

目的 探索马传染性贫血病毒 (EIAV)野毒株 (强毒 ,LN)和疫苗毒株 (弱毒 ,DLV)的囊膜蛋白GP90作为鉴别诊断试剂的效果及基因工程疫苗的可能性。方法 将中国EIAV疫苗株 (DLV)及其亲本毒株辽毒株 (LN)接种于驴外周血白细胞培养物 ,提取前病毒DNA ,并以其为模板 ,经聚合酶链法 (PCR)扩增出LN和DLV的GP90片段 ,在Bac to Bac杆状病毒表达系统表达。表达的GP90蛋白经金属离子亲和层析 (IMAC)纯化后免疫小鼠 ,ELISA法检测抗EIAV抗体 ,中和试验检测中和抗体活性。同时对DLV和LNGP90的核苷酸与氨基酸进行比较。结果 DLV和LNGP90核苷酸序列的同源性为95 3 % ,氨基酸序列的同源性为 87.7%。未加佐剂组抗体滴度为 80 0 ,佐剂组抗体滴度达 160 0 ;不加佐剂组的中和抗体滴度在 40～ 80之间 ,加佐剂组中和抗体滴度在 80～ 160之间。结论 成功构建了分别表达EIAV野毒株LN和疫苗毒株DLV囊膜蛋白GP90的重组杆状病毒 ,大量表达的蛋白纯化后纯度较好 。