Era蛋白(E.coli ras-like protein)——一个可能参与真、原核细胞信号调控的新分子开关

充足的证据表明:G蛋白作为真核细胞的重要分子开关参与细胞的增殖调控以及部分代谢调控过程。而近年来在大肠杆菌中新发现的Era蛋白(E.coli ras-like protein)则是与已知的三聚体G蛋白和小分子G蛋白不同的一种新的GTP结合蛋白。进一步的研究发现该类GTP结合蛋白不仅存在于原核的大肠杆菌中,而且在高等植物、人类细胞中均含有该蛋白的同源蛋白。大肠杆菌的Era蛋白主要位于细胞膜的内侧,在细胞质中也有一定的分布;真核细胞ERA(ERG)蛋白来源于原核细胞,定位于线粒体或叶绿体上。ERA或ERG蛋白有可能担负着与其它两类G蛋白同样重要的分子开关功能。已有的研究表明,Era蛋白参与调节原核生物的细胞分裂、细胞周期以及部分细胞代谢过程;在哺乳动物细胞中,ERA的同源蛋白可能与细胞周期的G1期调控以及细胞凋亡有关;真核植物中相关研究报道尚少,推测该蛋白可能与种子的正常发育有关。

Era蛋白(E.coli ras-like protein)-一个可能参与真、原细胞信号调控的新分子开关

充足的证据表明G蛋白作为真核细胞的重要分子开关参与细胞的增殖调控以及部分代谢调控过程。而近来在大肠杆菌中新发现的Era蛋白(E.coli ras-like protein)则是与已知的三聚体G蛋白和小分子G蛋白不同的一种新的GTP结合蛋白。进一步的研究发现该类GTP结合蛋白不仅存在于原核的大肠杆菌中,而且在高等植物、人类细胞中均含有该蛋白的同源蛋白。大肠杆菌的Era蛋白主要位于细胞膜的内侧,细胞质中也有一定的分布;一些证据表明,真核细胞ERA(ERG)蛋白来源于原核细胞,定位于线粒体或者叶绿体。近来的研究证据表明ERA或者ERG蛋白有可能担负着与其它两类G蛋白同样重要的分子开关功能。已有的研究表明Era蛋白参与调节原核生物的细胞分裂、细胞周期以及部分细胞代谢过程;在哺乳动物细胞中,同源蛋白ERA可能与细胞周期的G1期调控以及细胞凋亡有关;真核植物中相关研究报道尚少,推测该蛋白可能与种子的正常发育有关。本文主要介绍原核Era蛋白和真核ERA蛋白的结构特点以及功能研究进展。

大肠杆菌基因组中存在Era亲和蛋白的基因

构建了一个大肠杆菌基因组DNAλZAP表达文库 ,以Dig标记的Era为探针 ,从 4× 1 0 4 噬斑中筛选到一个与探针呈特异结合的噬斑 ,说明大肠杆菌基因组中确有Era亲和蛋白基因存在 .将该噬菌体中插段DNA前 80 0bp的测序结果与 1 996年底完成的大肠杆菌基因组全序列作同源性比较 ,发现该插段序列位于大肠杆菌基因组的第 2 67section .

候选hEra结合蛋白A19/GST的融合表达及其抗体的制备

目的:在大肠杆菌中表达候选人Era结合蛋白A19/GST融合蛋白,并制备兔抗A19抗体。方法:利用人Era蛋白全长作为诱饵,进行胎肝cDNA文库的酵母双杂交筛选。将得到的候选人Era结合蛋白A19的编码基因序列克隆入pACT2载体中,构建pACT2A19。用PCR扩增A19蛋白的编码基因序列,克隆入融合表达载体pGEX4T3中,构建A19的表达菌,并经IPTG诱导表达A19蛋白。用SDSPAGE分析及薄层扫描检测目的蛋白的含量。用A19蛋白免疫家兔制备抗血清,以Westernblot鉴定抗体的特异性并检测抗体的效价。结果:大肠杆菌中表达的A19蛋白占菌体总蛋白的30.2%。Westernblot分析显示,抗血清具有较高的特异性,其效价约为1∶4000。结论:成功地获得了候选的人Era结合蛋白A19,制备了兔抗A19抗血清,为后续Era功能的研究奠定了基础。

人Era蛋白在大肠杆菌中的高效表达及其纯化

目的 在大肠杆菌中对人的 era基因 (简称 hera)进行表达、纯化 .方法 PCR扩增 hera基因 ,测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体 p RSET- C,重组质粒 p RSETC-hera以大肠杆菌 BL2 1(DE3)为宿主菌 ,用 IPTG进行诱导表达 .然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化 .结果 克隆了 hera基因 ,测序正确 ;利用 p RSET- C载体在大肠杆菌中融合表达了全长 hera- c DNA基因 ,表达量占细菌总蛋白的 5 9.6 % .融合蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在 ,在变性条件下用 Ni- NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白 ,其纯度达到了 98.0 % .结论 利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了 hera基因 .

6His-hEra融合蛋白的高效表达

目的 :在原核表达系统中对人Era基因进行表达。方法 :人era编码区基因克隆入pUC19质粒中 ,经全自动序列分析仪测序正确后 ,再克隆入表达载体pRSETB中 ,构建成融合 6个组氨酸的高效表达载体pRSETB Era ,转化大肠杆菌BL2 1DE3(plysS)诱导表达。结果 :经IPTG诱导后 4h ,SDS PAGE及凝胶密度扫描分析 ,表达出分子量约 4 1kD的蛋白 ,占菌体总蛋白的 5 1 2 %。结论 :该基因在大肠杆菌中的高效表达为人era的功能研究打下了基础。

大肠杆菌中高表达重组Era可溶性蛋白的纯化及其生化特性

质粒pCE31含有在P_L起动子控制下的重组era基因,在大肠杆菌中、42℃诱导高表达出Era蛋白,经溶菌酶处理裂菌、沉淀离心洗涤后所得的纯Era是不溶的,生物活性也不高。改在40℃诱导2h,在Era底物GDP的存在下裂菌,60％以上的Era处于可溶状态。用蛋白酶抑制剂防止Era蛋白降解,经盐析、Q-SepharoseFF柱层析分离,获得可溶性纯Era蛋白。该蛋白能特异地与鸟苷酸结合、并具有GTP酶活性,表明Era是一种G蛋白。动力学定量分析结果:在4℃时,每分子Era肽链能结合一分子GTP或GDP,表明所纯化的Era蛋白几乎都具有活性;4℃下,Era蛋白与GTP或GDP结合的解离常数,分别为5.49和1.01μmol/L;37℃时,Era蛋白GTP酶的Km值为9.0μmol/L,催化GTP水解的最大速度为9.8mmolCTP/mol Era/min。

利用双启动子表达载体pDH2-YggG-P_(tac)-Era研究E.coli Era和YggG蛋白间的相互关系

yggG是从大肠杆菌全基因组文库中钓取并克隆的Era结合蛋白基因,研究表明该基因可能表达产物YggG294蛋白对宿主菌的生长具有强烈的抑制作用。为了阐明YggG294所引起的细菌生长抑制是否与Era相关,构建可同时可控性表达Era和YggG294蛋白的双启动子表达载体。利用所构建的双启动子表达载体在同一细胞中同时可控性地表达YggG294与Era蛋白。结果显示,在不表达和少量表达YggG294的细菌细胞内,Era的表达量与总蛋白量的比值随着诱导时间增加而增高,而YggG294大量表达的细菌内Era的表达量未明显改变,并且Era的表达量与总蛋白量的比值基本保持不变,但是在全细胞裂解液中并未检测到Era蛋白的降解产物;Era蛋白的预表达对YggG294表达所引起的细菌生长率下降无影响。上述结果说明,YggG294对Era蛋白无水解作用,YggG与Era蛋白间的相互作用与YggG294对细菌生长抑制作用无直接的联系。由此可以推论,Era与YggG294引起的细菌生长抑制无关,YggG294是通过其它途径引起宿主菌生长抑制。

小鼠ERA蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化

目的 :对小鼠ERA蛋白 (mERA)进行表达、纯化 ,为真核生物ERA功能研究奠定基础 .方法 :构建MBP mER A融合表达载体 .在大肠杆菌中诱导表达融合的小鼠ERA蛋白 ,经直链淀粉亲和层析纯化 ,WesternBlotting鉴定所表达纯化的蛋白 .结果 :表达的MBP mERA融合蛋白占菌体总蛋白的 1 8% ;纯化后的融合蛋白纯度为 70 % ;WesternBlotting证实了mERA蛋白的表达 .结论 :利用基因重组技术 ,在大肠杆菌中高表达了mera基因 ,并对融合蛋白进行了初步纯化 .

ERAS理念对老年腹腔镜结肠癌术后高敏-C反应蛋白和前白蛋白的影响

目的通过观察老年结肠癌患者术后高敏-C反应蛋白和前白蛋白水平,探讨ERAS理念对患者术后恢复的影响。方法 2016年12月至2018年12月本院收治老年结肠癌患者45例,其中接受加速康复外科治疗(试验组)22例,常规治疗(对照组)23例。比较两组患者术后肛门排气时间、排便时间、术后住院时间、手术前后高敏C-反应蛋白和前白蛋白、围手术期并发症等。结果试验组患者术后排气时间、排便时间、术后住院时间均显著低于对照组(P均<0.05),试验组术后超敏C-反应蛋白水平均显著低于对照组(P<0.05),试验组术后第4天及第7天的前白蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)。结论 ERAS理念能促进老年结肠癌术后恢复。

北京鸭呼肠孤病毒σA、σB蛋白的二级结构及B细胞抗原表位的预测

应用SOPMA方法和DNAStar Protean软件综合分析了北京鸭呼肠孤病毒分离株DRV-GZ株的σA、σB蛋白的二级结构、亲水性、表面特性、柔韧性和抗原指数，并对各个蛋白的B细胞抗原表位进行了预测．结果表明，σA蛋白的32～37，56—61，82—85，107～116，128～141，202～207，239—246，256～260，274—280，312～317，381—391和σB蛋白的62～86，117～125，141～163，179～186，270—275，287～289，343～345区域内或附近最有可能是B细胞抗原表位的优势区域．

猪雌激素受体α基因E区部分cDNA克隆与原核表达

采用逆转录PCR(RT-PCR)法从梅山猪子宫组织中扩增雌激素受体α(ERα)基因E区部分cDNA编码区546bp,并将其重组于谷胱甘肽转移酶(GST)融合表达质粒pGEX-6p-1中,经酶切、序列鉴定分析后,用该重组质粒转化大肠杆菌BL21,并经异丙基B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-ERαE融合蛋白,分子量约为49 ku,净灰度扫描融合蛋白占重组菌蛋白32%,结果表明成功构建GST-ERαE融合蛋白表达载体,并获得高效表达,为下阶段深入开展ERα蛋白功能研究打下了良好的基础。

蛋白质功能研究:历史、现状和将来

蛋白质是生命活动的直接执行者,参与生命的几乎所有过程,如遗传、发育、繁殖、物质和能量的代谢、应激等等。揭示生物体内成千上万种蛋白质的具体功能、完成功能的机制等是蛋白质研究的核心内容,是后基因组时代生命科学研究极富挑战的领域之一。本文就蛋白质功能研究的历史、现状和未来进行简要的讨论。希望能够帮助读者,特别是那些并不从事蛋白质研究的读者,更好地认识我国中长期科学与技术发展规划中制定“蛋白质研究”重大科学计划的必要性。

加速康复外科理念用于肝囊型肝包虫病外囊剥离手术治疗的效果观察

目的探讨加速康复外科理念用于肝囊型肝包虫病外囊剥离手术治疗的效果。方法选取拟行外囊剥离术治疗的肝囊型肝包虫病患者70例,将患者随机分成加速康复组和传统对照组,各35例。加速康复组患者应用加速康复外科理念治疗。传统对照组患者按照传统围术期治疗方案处理。观察并比较两组患者手术时间、术中出血量、术中与术后输血情况,手术前(术前1d)后(术后1d)血清C反应蛋白(CRP)、TNF-α、降钙素原(PCT)及空腹血糖水平,术后下床活动时间、进食时间、肛门排气时间及住院天数。结果两组患者手术时间、术中出血量、术中与术后输血情况及手术前CRP、TNF-α、PCT、空腹血糖水平比较差异均无统计学意义(均P>0.05);加速康复组患者术后CRP、TNF-α、PCT、空腹血糖水平均低于传统对照组(均P<0.05),术后下床活动时间、进食时间、肛门排气时间均早于传统对照组(均P<0.05),住院天数少于传统对照组(P<0.05)。结论加速康复外科理念应用于肝囊型肝包虫病外囊剥离术治疗中可以有效降低患者围术期应激反应与炎症反应,有助于患者快速康复。

拟南芥外源ERG基因的阳性苗的初步筛选

近来关于Era蛋白(E.coli ras-like protein)及其同源蛋白的研究较多,但其在真核生物中的功能仍不明朗,尤其是植物中相关研究报道尚少。拟南芥中有两个ERG蛋白,大小分别为437个氨基酸和427个氨基酸,分别用ERG437和ERG427表示。本文通过构建ERG基因的真核表达载体,利用农杆菌浸花法侵染拟南芥植株,筛选出阳性植株,为进一步定位观察和功能研究提供材料。

前列腺增生组织中间质细胞增殖和表型转化与雌激素受体α表达的关系

目的比较人正常前列腺(NP)和前列腺增生(BPH)中间质细胞标记蛋白、增殖细胞核抗原(PCNA)和雌激素受体α(ERα)的表达差异,并检测BPH组织间质细胞标记蛋白与PCNA或ERα同时呈阳性染色的细胞。方法对4例NP和8例BPH连续切片应用免疫组织化学方法,观察波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、肌球蛋白(myosin)、PCNA和ERα的表达定位。结果与NP相比在BPH中,α-SMA阳性染色细胞显著增加;波形蛋白在间质中阳性染色细胞有所增加,在腺泡基底层及临近腺泡外层间质中阳性染色细胞明显增加;在临近腺泡外的数层间质细胞中肌球蛋白和ERα由部分阳性变为完全阴性染色,而在远离腺泡的间质中其阳性染色细胞由散在斑块状分布变为簇状密集排列;PCNA在间质中阳性染色细胞有所增加,在基底细胞层中阳性染色细胞显著增加。连续切片免疫组织化学染色显示,在腺泡上皮基底层存在PCNA与波形蛋白、ERα共定位的细胞;在间质中存在肌球蛋白与ERα共定位的细胞。结论与NP相比,BPH间质细胞表型发生明显变化,且其增殖和表型转化与ERα表达定位的改变密切相关。

蛋白质组学及其研究进展

综述蛋白质组学的定义、研究策略、研究内容、主要研究技术及其在基础研究、农业、疾病研究、药物开发等方面的应用。

拟南芥悬浮细胞中ERG437蛋白的细胞定位的初步观察

近来在大肠杆菌中新发现的Era蛋白(E.coli ras-like protein)是一类新的GTP结合蛋白,研究表明Era蛋白参与调节细胞分裂、细胞周期以及部分细胞代谢过程。植物中相关研究报道尚少,推测ERG蛋白可能定位在线粒体,并且与种子的正常发育相关。本实验通过构建植物表达载体初步观察了ERG437蛋白在拟南芥悬浮细胞中的定位情况,同时利用CoxⅣ蛋白初步观察到绝大部分ERG437蛋白定位于线粒体。

拟南芥外源ERG基因的阳性苗的初步筛选

近来关于Era蛋白(E.coli ras-like protein)及其同源蛋白的研究较多,但其在真核生物中的功能仍不明朗,尤其是植物中相关研究报道尚少。拟南芥中有两个ERG蛋白,大小分别为437个氨基酸和427个氨基酸,分别用ERG437和ERG427表示。本文通过构建ERG基因的真核表达载体,利用农杆菌浸花法侵染拟南芥植株,筛选出阳性植株,为进一步定位观察和功能研究提供了材料。

基于加速康复外科理念行日间腹腔镜阑尾切除术的临床疗效观察

目的观察基于加速康复外科理念(enhanced recovery after surgery,ERAS)行日间腹腔镜阑尾切除术的临床疗效。方法选取2018-02~2019-10在该院行日间腹腔镜阑尾切除术治疗的90例急性阑尾炎患者,按随机数字表法分为观察组和对照组,每组45例。观察组行基于ERAS理念行围术期处理,对照组行常规围术期处理。比较两组术后首次下床活动时间、肛门排气时间、住院时间、术后6 h疼痛程度、并发症发生情况及术前、术后1 d时血浆C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)水平。结果观察组术后疼痛程度评分低于对照组,术后首次下床活动时间、肛门排气时间、住院时间短于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组术后并发症发生率为2.22%,低于对照组的17.78%,差异有统计学意义(P<0.05)。观察组术前血浆CRP水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),术后1 d两组血浆CRP水平较术前明显增高,但观察组血浆CRP水平低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论基于ERAS理念行日间腹腔镜阑尾切除术中围术期处理能减轻手术创伤,减轻术后疼痛程度及炎症反应,减少并发症发生,缩短术后恢复时间,值得临床推广。