新疆某医院侵袭性念珠菌感染的菌种分布、药物敏感性及耐药基因初步分析

目的了解新疆某医院侵袭性念珠菌感染的菌株分布、药敏特征,探讨菌株对唑类抗真菌药的耐药机制。方法对分离自临床诊断深部真菌病患者的125株菌行形态学和分子生物学鉴定,分析念珠菌菌种分布特点、对9种抗真菌药的体外敏感性以及对唑类药物耐药菌株行ERG11和PDR1基因测序分析。结果鉴定成功的111株酵母菌株中,分离率在前三位的菌种次为白念珠菌(50.45%)、光滑念珠菌(18.02%)和热带念珠菌(15.32%)。药敏结果显示多数菌株对两性霉素B、5-氟胞嘧啶和棘白菌素类药物敏感,2株光滑念珠菌菌株对棘白菌素类药物耐药。白念珠菌对唑类药物体外敏感性较好,泊沙康唑和伏立康唑对光滑念珠菌和热带念珠菌的体外抑菌活性较低(<60%)。33株唑类耐药念珠菌(6株白念珠菌、14株光滑念珠菌、11株热带念珠菌、1株克柔念珠菌和1株近平滑念珠菌)中有9株存在ERG11基因错义突变,所有唑类耐药光滑念珠菌均存在PDR1基因错义突变。结论侵袭性念珠菌感染的主要致病菌为白念珠菌;棘白菌素类、两性霉素B、5-氟胞嘧啶对念珠菌整体的体外抑菌活性较好,唑类药物对光滑念珠菌和热带念珠菌的抑菌活性较低;念珠菌ERG11和PDR1基因突变可能与唑类耐药相关。

白念珠菌对氟康唑耐药机制的研究

目的通过研究白念珠菌对氟康唑耐药相关基因ERG11、CDR1、CDR2和MDR1的表达水平及其与耐药的关系,旨在对本地区以白念珠菌感染为主的侵袭性念珠菌病的防治提供依据。方法选取延安地区两家三甲医院临床确诊的对氟康唑耐药及敏感的白念珠菌各10株,扩增其靶酶编码基因ERG11,分析突变位点;使用荧光染料罗丹明6G分析耐药组与敏感组菌株的外排情况;采用荧光定量PCR检测白念珠菌外排泵编码基因的表达水平。结果ERG11扩增测序结果显示,耐药菌株C3号虽发生了碱基位点突变,但并未引起编码氨基酸的改变,耐药菌株C7号及敏感菌株C12号发生了碱基位点的突变,引起编码氨基酸的改变;荧光染料罗丹明6G检测白念珠菌外排实验结果显示,耐药菌和敏感菌无论加入葡萄糖与否外排均存在显著差异,且耐药组加入葡萄糖较未加入葡萄糖外排量明显增加,差异有统计学意义(P<0.01);RT-PCR检测外排泵基因结果显示,CDR1与CDR2外排泵基因表达水平在耐药菌与敏感菌之间差异有统计学意义(P<0.05)。结论研究基因表达及外排泵功能检测结果均表明,本地区白念珠菌对氟康唑的耐药机制主要与外排泵基因过度表达相关,未发现靶酶编码基因有意义的突变。

3种念珠菌对氟康唑耐药的易感性及耐药机制比较

目的研究比较3种念珠菌对氟康唑耐药的易感性及其体外诱导耐药株的耐药机制。方法选取同一患者中同时分离的对氟康唑敏感的白念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌各1株,在体外氟康唑的作用下诱导其成为耐药株。采用罗丹明6G试验比较敏感株与耐药株的外排泵作用,RT-PCR检测外排相关基因CDR1、CDR2以及靶酶编码基因ERG11的表达,并对ERG11基因进行PCR扩增和测序,同时通过罗丹明123试验对3种念珠菌的线粒体膜电位(ΔΨm)进行检测。结果光滑念珠菌最易被氟康唑诱导为耐药株,其CDR1的过度表达引起外排泵作用增强。白念珠菌和热带念珠菌的诱导耐药株以ERG11表达增加为主,其中白念珠菌的ERG11存在V437I、A430V、S263L和T128K突变位点。此外,白念珠菌和光滑念珠菌的诱导耐药株表现为呼吸缺陷。结论不同念珠菌对氟康唑耐药的易感性不同,耐药机制也存在差异。

ERG11基因突变与白念珠菌对氟康唑耐药性的初步研究

目的探讨白念珠菌氟康唑作用的靶酶编码基因(ERG11)突变与氟康唑耐药性的关系。方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增临床分离的23株白念珠菌ERG11基因,包括2株耐氟康唑株、9株氟康唑剂量依赖敏感株和12株氟康唑敏感株,并进行双向测序。应用B last软件,将测序结果与网上已发表序列(GenBankAY856352)进行比对,以确定是否发生基因突变。结果23株白念珠菌的ERG11基因序列共检出16个同义突变位点和18个错义突变位点。错义突变中Y205E、I437V、A255V、E260V、K487N、G472R、N435V、D502E、K143Q为新发现的突变位点。结论Y205E、I437V、A255V位点突变发现于敏感株,可能与白念珠菌耐药无关;K487N、G472R、N435V、D502E、E260V发现于剂量依赖敏感株,K143Q发现于耐药株,可能与耐药的形成有关。

白念珠菌唑类耐药和生物膜相关基因的表达

目的研究白念珠菌临床分离株唑类耐药和生物膜形成相关基因的表达。方法收集上海市公共卫生临床中心2006至2011年92例感染性疾病患者[病毒性肝炎、结核、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)]血液、无菌部位和黏膜分离鉴定的白念珠菌104株,选用ATB FUNGUS3检测抗菌药物(氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑)的最低抑菌浓度(MIC),采用半定量逆转录聚合酶链反应(PCR)分析唑类敏感、浓度依赖性敏感(S-DD)和耐药菌株之间药物外排泵基因CDR1、CDR2、MDR1和药物靶酶基因ERG11表达的差异,同时通过甲基四氮盐(XTT)代谢试验筛选强生物膜形成能力菌株(HBFs),研究其与弱生物膜形成能力菌株(LBFs)相关基因ALS3和HWP1表达的差异。结果 104株白念珠菌中共检测出16株至少对1种唑类药物耐药,6株至少对1种唑类药物S-DD。药物靶酶基因ERG11在耐药株、S-DD株和敏感菌之间比较,差异有统计学意义(P=0.007 8),且耐药株、S-DD株分别与敏感菌比较,差异有统计学意义(P<0.05),然而CDR1、CDR2和MDR1表达量在3种菌株间无明显差异。生物膜形成能力试验显示16株菌生物膜形成能力增强,其HWP1表达量与LBFs比较差异有统计学意义(P=0.007 9),ALS3表达量差异无统计学意义。结论 ERG11基因的过度表达为白念珠菌唑类耐药的重要机制。菌丝细胞壁蛋白HWP1基因的高表达与白念珠菌生物膜形成增强相关。

白念珠菌14-α脱甲基酶K143Q氨基酸置换与氟康唑耐药形成的相关性研究

目的研究临床耐氟康唑白念珠菌14-α脱甲基酶的K143Q氨基酸置换与氟康唑耐药形成的关系。方法运用体外定点突变技术构建ERG11基因A427C突变型重组质粒,并利用酶切、连接构建YES2/CT酵母表达质粒。通过构建成的表达质粒在酿酒酵母中的异源性表达及体外药物敏感性表型的检测,分析其致K143Q氨基酸置换与白念珠菌对氟康唑产生耐药的关系。结果真菌体外药物敏感性表型检测显示,含氨基酸置换的表达质粒转染于酿酒酵母INVSc1后,氟康唑最低抑菌浓度(MIC)增加16倍。结论 K143Q可增强白念珠菌对氟康唑的耐药性。

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因PCR-RFLP比较分析

目的通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERGIl基因限制性片段长度多态性分析，比较两相细胞在DNA水平的差异。方法分别抽提来自同一亲本、对氟康唑敏感性不同的白念珠菌（CA-1，CA-2，CA-4，CA-6，CA-7，CA-9，CA-11，CA-13～CA-17）菌丝相与酵母相基因组DNA，根据ERG11基因序列设计一对引物，对其进行PCR扩增（包括部分上游和下游非编码区），扩增产物分别用AccⅠ和MunⅠ消化、琼脂糖凝胶电泳后观察。结果各株白念珠菌菌丝相与酵母相均能扩增出约1734bp大小的目的片段，CA-7，CA-14，CA．16和CA-17株两相细胞ERG11基因RFLP图谱存在差异，其余受试菌株未见差异。结论从DNA全貌来看，白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因存在差异。

PCR-反向点杂交法在外阴阴道念珠菌病诊断及白念珠菌耐药基因突变检测中的应用

目的评价PCR-反向点杂交法用于念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测的应用价值。方法收集念珠菌性阴道炎患者及体检健康妇女分泌物各285份和50份。用生物梅里埃酵母菌鉴定卡进行菌种鉴定,用最低抑菌浓度(MIC)法(郑州安图真菌快速培养鉴定药敏试剂)进行药敏试验;采用PCR-反向点杂交法(深圳亚能念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测试剂)进行菌种鉴定和耐药基因突变检测;采用PCR及测序方法进行耐药基因的检测。分别以培养鉴定法、MIC法、核酸序列测定法为对比方法,评价PCR-反向点杂交法念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测的敏感性、特异性及准确性。结果与培养鉴定法相比,PCR-反向点杂交法检测6种念珠菌菌种的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和总符合率分别为95%、96%、96%、98%、97%以上,2种方法检测6种念珠菌(白念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌和季也蒙念珠菌)结果的差异无统计学意义(χ~2值分别为0.44、0、0、0、0和0,P均>0.05),一致性较好(Kappa均>0.9)。与MIC法相比,PCR-反向点杂交法检测白念珠菌耐药的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和总符合率分别为98%、88%、98%、88%和96%,2种方法检测结果的差异无统计学意义(χ~2=0.17,P>0.05),一致性较好(Kappa>0.8)。PCR-反向点杂交法与核酸序列测定法相比,对6种白念珠菌耐药基因突变位点的检测结果完全一致。结论PCR-反向点杂交法在念珠菌菌种鉴定及白念珠菌耐药基因突变检测上与培养鉴定法以及核酸序列测定法的一致性高,比传统检测方法更早期更快速,可应用于外阴阴道念珠菌病(VVC)的辅助诊断。

白假丝酵母菌吡咯类药物相关耐药基因的突变和表达

目的了解白假丝酵母菌吡咯类药物相关耐药基因的突变和表达情况。方法采用裂解法提取白假丝酵母菌DNA,扩增ERG11基因后测序,选取3种吡咯类药物(氟康唑、酮康唑、咪康唑)均耐药的全耐药菌株DNA片段进行TA克隆;利用荧光定量PCR技术对CDR1、CDR2、MDR1基因表达的m RNA进行相对定量,比较耐药株与敏感株表达水平的差异。结果 37株耐吡咯类白假丝酵母菌中,ERG11存在41个碱基突变位点,其中20个同义突变,21个错义突变,发现新变异:N12I、Y13F、S16F、V36F、V51L、G129E、T123I、E194K、K344N、E517G、V234A;CDR1基因2-ΔΔCt值敏感株为1.09±0.27,耐药株为1.46±0.24,两者比较差异有统计学意义(P<0.05);敏感株与耐药株间CDR2和MDR1基因的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论白假丝酵母菌耐药机制较为复杂,可能与ERG11某些位点突变导致的氨基酸变异和CDR1高表达有关,CDR2和MDR1表达与耐药关系有待进一步研究。

安徽省耐唑类药物白念珠菌ERG11基因的突变研究

目的了解安徽省临床分离的对唑类药物(氟康唑﹑伊曲康唑﹑伏立康唑)耐药白念珠菌的ERG11基因突变情况,探讨其与耐药的关系。方法用沙保弱培养基对安徽省40所医院2012年9月份收集的198株白念珠菌进行培养﹑分离,科玛嘉显色培养基进行鉴定。采用微量稀释法测定其对唑类药物的敏感性,提取筛选出耐药的菌株及3株敏感株的基因组DNA,设计一对引物扩增其ERG11基因,扩增后送之测序,测序结果与GenBank中的已知标准序列(X13296)进行比对分析。结果 PCR产物电泳后均成功获得预期大小的片段,测序结果比对分析发现34个不同的碱基突变位点,其中错义突变位点为14个。结论本研究发现耐唑类药物的白念珠菌存在多个错义突变位点,且多为多位点突变,可能与其耐药性的产生有关,其中T123I、Y334S、V452D和L480F目前尚未见相关报道。

白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较研究

目的 通过对白念珠菌菌丝相与酵母相ERG11基因部分序列的比较,探讨两相在DNA水平的差异。方法 对5株分离自同一HIV阳性患者的白念珠菌分别进行菌丝相与酵母相培养后,抽提基因组DNA,PCR扩增ERG11基因(包括部分上游和下游非编码区),用下游引物对部分ERG11基因进行测序。结果CA-7菌丝相与酵母相ERG11基因序列存在差异,分别位于第1547,1587和1617位点。结论 白念球菌菌丝相与酵母相在DNA水平存在差异,在进行白念珠菌的病原真菌学研究中菌丝相为适宜的研究对象。

ERG11基因与热带念珠菌唑类药物耐药关系的研究

目的探讨临床唑类药物耐药热带念珠菌菌株ERG11基因突变及表达情况。方法连续收集临床分离的热带念珠菌菌株,采用微量肉汤稀释法检测其对氟康唑、伏立康唑及伊曲康唑的药物敏感性,对唑类药物耐药菌株及部分敏感菌株进行ERG11基因测序,同时采用RT-PCR测定ERG11基因表达量。结果临床共分离92株热带念珠菌菌株,其中有29株为唑类药物耐药菌株,耐药率31.52%。40株热带念珠菌(29株耐药菌株和11株敏感菌株)ERG11基因序列共发现2个错义突变(S154F、Y132F)和5个同义突变,其中24株唑类药物耐药菌株同时出现上述两个错义突变位点。实时荧光定量PCR结果显示,在29株唑类药物耐药菌株中有19株其ERG11基因表达量较敏感菌株增高。分析16株对3种唑类药物全耐药菌株及其余13株仅对一种或两种药物耐药菌株,显示前者ERG11基因表达水平高于后者,差异有统计学意义。结论临床热带念珠菌唑类药物耐药与ERG11基因突变及过表达有关,有关热带念珠菌唑类药物的耐药机制还需进一步研究。

假丝酵母菌ERG11和ERG3基因突变与氟康唑耐药的研究

目的 分析假丝酵母菌ERG11和ERG3基因突变情况及其对氟康唑耐药的机制。方法 100株念球菌,体外药敏试验获得耐氟康唑的热带假丝酵母菌5株和白色假丝酵母菌9株,提获DNA,基于聚合酶链式反应(PCR)分别扩增分为以上假丝酵母菌的ERG11、ERG3基因。比较分析PCR产物和GenBank数据库外供的基因序列,进而探寻到基因突变点。结果 ITS1扩增后形成了片段规格类似的条带,在500~620 bp范围中。鉴定发现,分离到的100株假丝酵母菌内,其中热带假丝酵母菌、白色假丝酵母菌占真菌总数的65%,分别有15株和50株。其中9株白色假丝酵母菌株的氟康唑24 h最小抑菌浓度(MIC)>16 mg/L,确定其是耐药菌株;5株热带假丝酵母菌对氟康唑和伏立康唑双重耐药。PCR对临床分离获得的14株假丝酵母菌进行扩增,都获得了预期产物,规格和DNA Marker相比较,部位吻合,未形成非特异性产物带。基于Blast比较热带假丝酵母菌和白色假丝酵母菌的测序结果 ,将起始密码子ATG的A计数设定成1,基于此探寻到突变基因。5株热带假丝酵母菌ERG11基因存有同义、错义突变分别为5、4个,错义突变分别是Y132H、G487T、A530C、G533C;ERG3基因依次有7个和12个;白色假丝酵母菌ERG11和ERG3基因各发现4个同义突变,前者有3个错义突变,后者为0。分析ERG11基因序列以后,发现其在氟康唑敏感菌株仅是发生了单个突变,康唑剂量自身依赖敏感程度和耐药菌株内ERG11基因突变以多位点错义突变同时出现为主。结论 假丝酵母菌ERG11、ERG3均存在程度不一的突变,其可能参与假丝酵母菌耐药性形成过程。

热带假丝酵母菌ERG11基因突变与氟康唑耐药性的关系

目的探讨热带假丝酵母菌氟康唑作用的靶酶编码基因(ERG11)突变与耐药性的关系。方法根据ERG11序列设计引物,对氟康唑靶酶基因ERG11进行PCR扩增,DNA测序后对比分析耐药株与敏感株及标准株的碱基差异,确定耐药株基因一级结构上的突变点,并推测分析靶酶蛋白的氨基酸改变及与氟康唑耐药的关系。结果氟康唑敏感株的ERG11基因DNA序列与氟康唑敏感标准株ATCC750完全一致,耐药株出现+395、+513、+783处点突变,导致132位氨基酸改变。结论ERG11基因突变所编码的氨基酸改变与氟康唑耐药有关。

耐唑类药白念珠菌ERG11基因点突变

ERG11是唑类抗真菌药对白念珠菌作用靶酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶(14DM)的编码基因,ERG11基因的有义突变会使靶酶发生氨基酸置换,影响酶与药物分子的结合,是导致菌株耐药的原因之一。14DM具有特定的空间构型,突变所处的位置决定能否导致菌株耐药,已发现的60余种ERG11点突变里面,仅有数种被实验证实可致耐药。

白念珠菌ERG11基因突变及高表达对耐药的影响

目的 探讨白念珠菌ERG11基因突变、高表达及二者的相互作用在氟康唑耐药中的作用.方法 采用PCR法扩增实验菌株的ERG11基因,并进行测序及生物信息学分析,筛查突变位点;抽提实验菌株总RNA,并逆转录合成cDNA,采用实时荧光定量PCR（FQ-RT-PCR）法检测ERG11基因的表达水平.结果 24株临床菌株中,共检测出ERG 11基因存在24个同义突变位点和5个错义突变位点,其中,E174A、T123I、V234F为新发位点;白念珠菌ERG11基因在耐药组中的表达量高于敏感组,差异具有统计学意义未发生错义突变的白念珠菌耐药株ERG11基因的表达量高于发生错义突变的,差异具有统计学意义.结论 白念珠菌ERG 11基因的5个错义突变A114V、E174A、T123I、Y132H、V234F可能与氟康唑耐药形成有关;ERG11基因的高表达可能与氟康唑耐药有关;ERG11基因的错义突变可能对该基因的高表达存在抑制作用.

白假丝酵母菌耐吡咯类药物的ERG11基因分析

目的 研究白假丝酵母菌耐吡咯类药物的ERG11的变异情况.方法 将93例诊断为真菌性阴道炎的患者的阴道分泌物标本进行真菌培养,筛选白假丝酵母菌菌株,利用纸片扩散法进行氟康唑、酮康唑、咪康唑药敏试验,用加热裂解法提取菌株DNA,扩增ERG11基因,扩增后的PCR产物进行双向测序,测序结果与GenBank中的标准序列（SC5314）比较分析.结果 93例均培养出假丝酵母菌,包括60株白假丝酵母菌,19株热带假丝酵母菌,9株克柔假丝酵母菌和5株光滑假丝酵母菌;白假丝酵母菌对氟康唑、酮康唑、咪康唑耐药率分别为13.33%,20.00％和51.67％;对白假丝酵母菌的ERG11基因测序发现存在25个碱基突变位点,其中13个同义突变,12个错义突变,其中有6个是新变异：V36F,V51L,T123I,E194K,Y257H和K344N.结论 耐吡咯类药物白假丝酵母菌ERG11基因有多个错义突变位点,其中某些位点突变导致的氨基酸变异可能与其耐药性产生有关.

近平滑念珠菌ERG 11基因编码区的克隆及生物信息学分析

目的克隆、测序近平滑念珠菌ERG11基因的编码区序列并进行生物信息学分析。方法运用生物信息学的方法 ,通过与白念珠菌ERG11基因碱基序列同源性比对,在近平滑念珠菌基因组(www.sanger.ac.uk/sequencing/Candida/pa-rapsilosis/)中寻找可能的ERG11基因序列(CpERG11),并据此序列设计引物,经PCR扩增近平滑念珠菌标准株(ATCC22019)的ERG11基因片段,产物经电泳、纯化、克隆到质粒prG-AMAI-NotI中,转染DH10B大肠杆菌细胞,并酶切鉴定筛选阳性克隆测序分析。结果近平滑念珠菌ERG11编码区由1569个碱基组成,编码一段含522个氨基酸的多肽。近平滑念珠菌ERG11的编码区序列与白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、酿酒酵母菌ERG11基因的同源性分别为74%、75%、65%、64%。该近平滑念珠菌ERG11的编码区为唑类药物作用靶酶基因。结论成功克隆、测序、并生物信息学分析近平滑念珠菌ERG11基因的编码区序列,为进一步的功能研究奠定基础。

念珠菌ERG11基因耐药机制研究进展

近年来，随着医疗技术与经济的发展，侵袭性真菌感染尤其是念珠菌感染病例持续增高。由于唑类药物的广泛应用，临床念珠菌耐药菌株不断出现，使得对耐药机制的深入研究迫在眉睫。在念珠菌对唑类药物的耐药机制中，麦角甾醇合成通路上ERG11基因的突变和高表达被视为念珠菌最重要的耐药机制之一，而ERG11基因突变和高表达可能是多种机制共同作用的结果。

临床分离光滑假丝酵母菌唑类药物耐药机制研究

目的了解光滑假丝酵母菌临床分离株中唑类耐药株的耐药机制。方法收集2009年和2010年5家医院28例患者的38株光滑假丝酵母菌,根据CLSI M27-A3指南采用微量肉汤稀释法测定5种常用抗真菌药物(两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑)的最小抑菌浓度。采用Real-Time PCR法检测CDR1、CDR2及SNQ2等外排泵基因以及ERG11和转录因子PDR1的表达;流式细胞仪分析罗丹明6G外排能力,考察细胞膜外排泵功能;同时,PCR扩增ERG11基因全长以及PDR1基因主要功能区并测序比对。结果 38株光滑假丝酵母菌对两性霉素B和5-氟胞嘧啶均敏感,其中17株为唑类耐药菌。唑类耐药株CDR1基因表达明显高于敏感株(P=0.001),并且对罗丹明6G外排能力也显著强于敏感菌(P=0.001)。光滑假丝酵母菌敏感和耐药菌株ERG11表达差异无统计学意义(P=0.283),且ERG11基因未发现突变。此外,17株光滑耐药菌株PDR1基因表达量与敏感菌株比较差异无统计学意义(P=0.086),但每株耐药菌株PDR1基因均分别发现1处有义突变。结论转录因子PDR1突变、外排泵基因CDR1表达上调以及外排泵功能增强是目前临床上光滑假丝酵母菌唑类药物耐药的主要机制。