中华绒螯蟹(Eriocheir japonica sinensis)内转录间隔区1(ITS1)大小变异的研究(英文)

在对中华绒鳌蟹(Eriocheirjaponicasinensis)(又称河蟹)核糖体DNA内转录间隔区1(ITS1)进行研究时,由于在软甲亚纲中还没有已知序列和5.8SrDNA序列的报道,所以在设计引物时,主要参考了其它节肢动物的序列。用此引物对河蟹的ITS1进行扩增,发现其个体内ITS1如同其他一些无脊椎动物一样,存在其大小变异。为了进一步确证这一发现,首先将得到的所有扩增产物进行测序,然后再扩增出河蟹的整个ITS区并测序。通过所得序列的比较,发现河蟹个体内ITS1的大小变异是由引物错配而引起的赝相。为了检验这一结论的可靠性,该文在测出河蟹5.8SrDNA序列的基础上,重新设计了引物,并再次扩增了河蟹的ITS1,然后对产物进行测序,最后再同上述结果进行比较;同时在改变扩增条件的情况下用原引物重新扩增ITS1,并检验其结果。最终证实河蟹个体内ITS1的大小变异是由引物错配而引起的赝相。该文同时还报道了中华绒螯蟹ITS1的序列。

中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体COI基因片段的序列比较研究

以相应引物 PCR扩增了黄河口中华绒螯蟹线粒体细胞色素氧化酶 I亚基基因 (COI)片段 ,PCR产物经 T载体连接之后进行克隆、测序 ,得到 70 9bp的碱基序列 ,其 A,T,G,C含量分别为 34.4 1% ,2 7.93% ,2 0 .0 3%和 17.6 3%。并比较它与珠江流域中华绒螯蟹 COI序列和日本绒螯蟹 COI序列的差异 ,发现黄河口中华绒螯蟹与珠江流域中华绒螯蟹 COI序列完全相同 ,而与日本绒螯蟹差异非常明显 ,70 9或 6 5 8(不计引物 )位点中核苷酸差异数为 32 ,核苷酸差异率为 4 .5 1%或 4 .86 % (不计引物 ) ,其中 2 5个位点为转换 ,7个位点为颠换。作者倾向于支持存在中华绒螯蟹和日本绒螯蟹 。

中华绒螯蟹卵巢差减cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术构建中华绒螯蟹卵巢两个发育时期的差减cDNA文库。正向差减杂交以Ⅲ期卵巢为试验方、Ⅱ期卵巢为驱动方 ,反向差减杂交以Ⅱ期卵巢为试验方、Ⅲ期卵巢为驱动方 ;将所获差减cDNA片段克隆入质粒表达载体 ,转化大肠杆菌JM 10 9。最后获得的正、反向差减文库分别含 86 3、 36 0个重组子。PCR扩增鉴定正、反向差减cDNA文库的插入片段平均大小分别为 36 0和 16 0bp 。

中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹两地理亚种的线粒体DNA序列变异

根据线粒体16SrDNA的PCR/RFLP鉴定和对Cytb基因全序列的分析对中国大陆7水系绒螯蟹地理种群的遗传分化进行探讨。结果表明:中华绒螯蟹与合浦绒螯蟹两亚种在17条Cytb全序列上以40个固定的碱基变异位点相区别。前者分布在瓯江及其以北的水系;后者主要分布在瓯江及其以南的水系。发现了4种在鸭绿江以南的北方水系中生活的合浦亚种单元型,对这些单元型的形成提出了3种可能的解释[动物学报51(5):862-866,2005]。

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(MIH1)基因的cDNA片段克隆和Northern印迹分析

根据其他蟹类蜕皮抑制激素的氨基酸序列设计了简并引物,运用RT PCR和RACE技术,从中华绒螯蟹(E riocheirjaponicasinensis)成体的蜕皮间期眼柄中,克隆了1条长1145bp的cDNA。该cDNA编码60个氨基酸,包括942bp的3′端非翻译区。同源性分析结果表明,该cDNA编码的氨基酸序列和其他蟹类蜕皮抑制激素有较高的一致性,最高的一致性为64%,将获得的序列命名为中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因(GenBank检索号:AY309062)。用Northern印迹分析的方法对处于各个发育阶段的胚胎及状幼体期该基因的表达进行了研究,结果表明,处于胚胎发育早期的卵裂期几乎没有检测到杂交信号,而胚胎发育的其他时期和状幼体期都检测到蜕皮抑制激素1基因的mRNA。中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因部分cDNA序列的获得为进一步获得该基因的全长cDNA、研究其功能及阐明中华螯蟹蜕皮的分子机制奠定了基础。

中华绒螯蟹线粒体COⅡ基因全序列测定

通过克隆测序方法 ,报道了中华绒螯蟹 (Eriocheirjaponicasinensis)线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅱ (COⅡ )基因全序列 .与已知甲壳动物线粒体同源序列的比较显示 ,绒螯蟹COⅡ基因的核苷酸组成及其编码的氨基酸组成与软甲类甲壳动物最相近似 .其序列组成与密码子使用对A、T核苷酸没有明显的偏倚 .对中华绒螯蟹COⅡ全序列及其序列特征的研究 。

中华绒螯蟹卵巢RACE cDNA文库的构建

应用抑制性差减杂交技术 ,已经获得了中华绒螯蟹卵巢发育过程中差异表达基因的部分cDNA序列。为了进一步获得基因的全长cDNA序列 ,运用SMART技术 ,成功构建了中华绒螯蟹卵巢 (Ⅲ期 )RACEcDNA文库。琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,文库所含全长cDNA的长度主要集中在 5 0 0～ 2 0 0 0bp之间 ,RACEPCR结果表明 ,所用基因特异性引物与接头引物皆能扩增出产物 ,说明所构文库的质量较好 ,适于用RACE方法从中分离中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的全长cDNA。

10个日本绒螯蟹群体与中华绒螯蟹形态的主成分分析

以10个日本绒螯蟹Eriocheirjaponica群体和1个中华绒螯蟹E sinensis群体为研究对象,分别测量了18个形态性状参数,数据经标准化后,对绒螯蟹群体形态差异进行了主成分分析。研究结果表明:1)冲绳以外的日本绒螯蟹群体的形态学特征存在较大的相似性,个体间有明显交叉;2)冲绳日本绒螯蟹群体与其它群体间形态差异较大,其多数个体与其它群体的个体分为两大支;3)中华绒螯蟹与日本绒螯蟹存在明显差异,可分为明显的两大支。

中华绒螯蟹、日本绒螯蟹及其杂交种成体主要矿物质元素含量比较

研究了中华绒螯蟹、日本绒螯蟹及其杂交种成体肌肉、性腺和肝胰腺中的主要矿物质元素组成及含量,结果显示:(1)3种群绒螯蟹雄体肌肉中,K、P和Zn的含量无显著差异;中华绒螯蟹的Na、Mg和Cu含量显著高于其他两种,但Mn和Fe含量最低;日本绒螯蟹肌肉中的Ca含量最低。就精巢而言,3种群蟹精巢中的Na和Mg含量无显著差异;日本绒螯蟹的Mn和Fe含量最高,杂交种的K、P和Zn含量最低,而中华绒螯蟹的Ca和Cu含量最低。就肝胰腺而言,3种群蟹的Mg、Ca和P含量无显著差异;杂交蟹的Na、K和Mn含量显著高于其他两种蟹,但其Fe含量最低;中华绒螯蟹和日本绒螯蟹则分别具有最高的Cu和Zn含量。(2)3种群绒螯蟹雌体肌肉中,5种常量元素的含量均无显著差异;中华绒螯蟹的Cu、Zn和Mn元素含量最高,而日本绒螯蟹的上述微量元素含量最低。3种群绒螯蟹卵巢中的9种主要矿物质元素含量均存在显著差异,中华绒螯蟹卵巢中的Na、P、Mg和Zn含量高于其他种群,除杂交种的Na和中华绒螯蟹的K含量最低外,日本绒螯蟹卵巢中其他6种元素含量均最低。肝胰腺中,3种群绒螯蟹的矿物质整体含量排序为:日本绒螯蟹>中华绒螯蟹>杂交蟹。整体上,3种群绒螯蟹肌肉中的Na、Mg、Cu和Zn含量低于海水蟹类,但Ca、P和K含量高于大部分海水蟹;3种群绒螯蟹矿物质元素组成模式较为接近,但仍存在一定的种间差异。

固定标本的DNA提取及PCR扩增

报道福尔马林、酒精固定的日本绒螯蟹标本的 DNA提取及 PCR扩增 ,并与冷冻、煮沸标本进行了比较。结果表明 ,福尔马林固定标本与酒精固定标本一样可以提取 DNA,加入的蛋白酶 K量越多 ,DNA的回收率越高。以提取的 DNA为模板 ,进行了线粒体 DNA12 S r RNA和 D- loop基因片段的 PCR扩增 ,经琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物后均得到了与期待的碱基长度相一致的清晰谱带。

中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体DNA 12S rRNA序列的比较

参考果蝇和蚤状的线粒体DNA 12SrRNA序列进行了中华绒螯蟹与日本绒螯蟹的线粒体DNA12SrRNA基因片段的引物设计、PCR扩增及序列测定。两种的碱基序列长度相同 ,为 45 7bp ,其A、T、G、C含量相似 ,分别为 15 9bp (34.79% )、177bp (38.73 % )、5 1bp (11.16 % )、70bp (15 .32 % )和15 9bp(34.79% )、178bp(38.95 % )、5 0bp(10 .94% )、70bp(15 .32 % )。中华绒螯蟹与日本绒螯蟹间有 5处碱基序列差异 ,在 98bp、15 1bp、317bp和 417bp碱基处为碱基转移 ,在 2 94bp碱基处为碱基颠换。

日本绒螯蟹与不同水系中华绒螯蟹的形态比较

对日本绒螯蟹 (Eriocheirjaponica)与辽河、长江、瓯江、闽江、南流江水系中中华绒螯蟹 (E .sinensis)的形态特征进行了比较研究。与中华绒螯蟹相比 ,日本绒螯蟹的特征是头胸甲亚方形或圆形 ;额齿形态圆钝或尖锐 ;侧齿 4个但其中第 4侧齿仅具痕迹或侧齿 4个 ,明显 ;第一龙骨脊颗粒状突起不明显或明显 ;头胸甲背部疣状突 4个或 6个 ;体青绿色具网状细纹或墨绿色、古铜色 ;第五对步足跗节宽呈桨状 ,宽为长的 0 .5倍或宽扁不呈桨状 ,宽仅为长的 0 .4 - 0 .5倍 ;趾节桨状 ,宽为长的 0 .2 3倍或趾节爪状 ,短爪状 ,基部为长的 0 .18- 0 .2倍等。不同水系的中华绒螯蟹 ,在形态上虽然存在一定的差异 ,但其差异不大 。

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH1)-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

蜕皮抑制激素(molt-inhibitinghormone,MIH)属甲壳动物高血糖激素(crustaceanhyperglycemichormone,CHH)家族。MIH抑制Y 器官蜕皮激素的合成。以中华绒螯蟹(Eriocheirjaponicasinensis)眼柄总RNA为模板,根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Eriocheirjaponicasinensismolt inhibitinghormone 1,Ers MIH1)基因序列设计引物,用RT PCR的方法获得了Ers MIH1基因成熟肽的cDNA片段。序列分析表明,Ers MIH1基因成熟肽编码区含有228bp,编码75个氨基酸残基,与已发表的序列一致。将该cDNA片段插入到中间载体pMD18 T中,酶切后再将该片段插入到pGEX 4T 1表达载体中,构建成表达质粒pGEX 4T MIH1。在BL21细胞中经IPTG诱导表达,得到GST MIH1的融合蛋白。SDS PAGE分析表明,经0.1mmol/LIPTG诱导4h,发现大量GST MIH1融合蛋白表达,在分子量(Mr)为34kD处有1条特异的蛋白质条带。中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1融合蛋白的成功表达为进一步深入研究MIH在中华绒螯蟹蜕皮过程中的作用机制奠定了基础。

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH1)基因组DNA的分子克隆和序列分析

运用反向PCR (IPCR)技术首次克隆得到全长为 3 50 6bp的中华绒螯蟹 (Eriocheirjaponicasinensis)蜕皮抑制激素 1(MIH 1)基因组DNA序列 (GenBank检索号 :AY3 10 3 13 )。该序列包括 3个外显子、 2个内含子、 412bp的 5′端上游调控区和 917bp的 3′端UTR。编码区的第 1个内含子将信号肽分开 ,第 2个内含子将成熟肽分开。MIH 1基因的外显子和内含子接头区符合受体拼接点和供体拼接点的GT AG法则。MIH 1基因412bp的 5′端侧翼区含有和其它真核基因相似的启动子元件 ,即包括与其它节肢动物高度相似的起始子、TATA盒以及cAMP效应元件结合蛋白的结合位点序列。中华绒螯蟹MIH 1基因的组织方式与斑纹和食用黄道蟹的MIH基因相同。推导的多肽由 75个氨基酸的成熟肽和 3 5个氨基酸的信号肽组成 ,成熟肽的氨基酸序列和食用黄道蟹、三叶真蟹及美洲黄道蟹的一致性在 64%

日本绒螯蟹线粒体DNA序列研究I.12SrRNA

参考果蝇与蚤状序列进行了日本绒螯蟹线粒体DNA的12SrRNA基因片段的引物设计、PCR扩增及序列测定,得到457bp的碱基序列,其中A、T、G、C含量分别为159bp(34.79%)、178bp(38.95%)、50bp(10.94%)、70bp(15.32%)

日本绒螯蟹放流群体12S rRNA序列研究

参考果蝇与蚤状溞序列进行了日本绒螯蟹放流群体的线粒体ＤＮＡ １２Ｓ ｒＲＮＡ基因片段的引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定，得到４５７ｂｐ的碱基序列，其Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量分别为１５８ｂｐ（３４．５７％）、１７８ｂｐ（３８．９５％）、５１ｂｐ（１１．１６％）、７０ｂｐ（１５．３２％），与果蝇与蚤状溞相同基因片段序列含量相似。

日本绒螯蟹太平洋群体和日本海群体12SrRNA序列比较研究

参考果蝇与蚤状■线粒体 ＤＮＡ１２Ｓ ｒＲＮＡ基因片段序列进行了日本绒螯蟹太平洋群体和日本海群体的相同片段的引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定。４群体日本绒螯蟹的碱基序列完全相同，为４５７ ｂｐ，其 Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量分别为１５９ ｈｐ（３４．７９％）、１７８ ｂｐ（３８． ９５％）、５０ ｂｐ（１０． ９４％）、７０ ｂｐ（１５． ３２％）。

日本绒螯蟹线粒体DNA序列研究Ⅱ.16S rRNA

参考果蝇、卤虫与锯缘青蟹的线粒体 DNA16 S r RNA基因序列进行了日本绒螯蟹相同基因片段的引物设计、PCR扩增及序列测定 ,得到 56 7bp的碱基序列 ,其 A、T、G、C含量分别为194 bp(34.2 2 % )、2 16 bp(38.10 % )、98bp(17.2 8% )、59bp(10 .4 1% ) ,与果蝇、卤虫及锯缘青蟹类的 16 S r RNA基因片段序列含量相似。

中华绒螯蟹卵巢新基因EJO6的全长cDNA克隆和序列分析

利用RACE技术从中华绒螯蟹卵巢获得了新基因EJO6(Eriocheirjaponicaovarygene6,EJO6)的全长cDNA序列(GenBank检索号:AY185922).该cDNA序列长度为1250bp,开放阅读框为690bp,编码229个氨基酸.根据氨基酸序列计算的相对分子质量和等电点分别为24270和11 9.同时用生物信息学的方法对该基因的结构和功能进行了初步分析.

中华绒螯蟹卵巢新基因EJO5的全长cDNA克隆和序列分析

利用RACE技术从中华绒螯蟹卵巢获得了新基因EJO5 (Eriocheirjaponicaovarygene 5 ,EJO5 )的全长cD NA序列 (GenBank检索号 :AY185 92 1) .该cDNA序列长度为 14 2 5bp ,开放阅读框为 5 85bp ,编码 194个氨基酸 .根据氨基酸序列计算的相对分子质量和等电点分别为 2 2 3 44和 9 5 .用生物信息学的方法未能得到对该基因功能预测的信息 .