芋头软腐病拮抗菌的筛选及生防效果研究

分别从蔬菜田土壤和采后芋头表面黏附土壤中分离纯化到267和244株菌株,通过平板拮抗实验,发现其中6个菌株对胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora,Ecc)产生了清晰且明显的拮抗圈(直径>10 mm)。利用芋头对它们的生物防控效果进行复筛,结果发现BGP14菌株发酵液处理芋头的发病率仅为6.7%,显著低于其他5个菌株(P<0.05)。根据BGP14的形态学特征、芽孢产生及16S rRNA和gyrB基因的部分核酸序列,该菌株被鉴定为解淀粉芽孢杆菌BGP14(Bacillus amyloliquefaciens)。BGP14在芋头伤口上具有较强的定殖能力,并将病原菌Ecc的群体数量压制在一个较低水平。BGP14与病原菌Ecc联合处理芋头的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活性显著高于其他处理。以上结果表明,解淀粉芽孢杆菌BGP14对病原菌E.carotovora具有强大的拮抗活性,能够有效防治贮藏期芋头软腐病,具有潜在的应用开发前景。

胡萝卜软腐欧文氏菌分子检测技术的研究

胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝卜亚种Erwinia carotovorasub sp.carotovora(Ecc)是引起魔芋和马蹄莲软腐病的主要病原细菌.本研究根据细菌L-氨基酸渗透酶同源基因设计URP核苷酸序列特异性引物进行普通PCR、巢式PCR,同时采用细菌16S-23S rDNA间的ITS序列设计引物及TaqMan探针进行实时荧光PCR,对样品中存在的胡萝卜软腐欧文氏菌进行检测,并比较了3种检测方法的特异性和灵敏度.结果表明,应用实时荧光PCR方法检测样品,其中存在的胡萝卜软腐欧文氏菌的最低菌悬液浓度可达10 cfu/mL;巢式PCR灵敏度也可检测到10 cfu/mL;而用普通PCR最低可检测到103cfu/mL.用实时荧光PCR和巢式PCR方法检测病菌,其灵敏度都比常规PCR提高了100倍,且实时荧光PCR方法更快速、简便、安全、准确,不需PCR的后续处理.实时荧光PCR方法适用于种苗、种球等检测领域.

几种化学物质诱导彩色马蹄莲对软腐病抗性的研究

本试验测定了纳米硅、草酸、硅酸钠和硫酸亚铁4种化学物质在不同浓度下对彩色马蹄莲软腐病菌的室内抑菌活性和诱导抗病效果。结果表明,硫酸亚铁3种浓度对彩色马蹄莲软腐病菌均表现较强的抑制作用;1 g/L纳米硅、0.15 g/L草酸和0.2 g/L硅酸钠3种化学物质对软腐病菌无明显抑制作用且诱导抗病效果较好,分别达到62.28%、77.56%、88.46%;经3种化学物质诱导处理后再进行接种,诱导处理和接种期间彩色马蹄莲叶片组织内过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)酶活性均高于对照,其中硅酸钠处理后彩色马蹄莲叶片组织内POD、PAL活性高于纳米硅和草酸处理,草酸处理后叶片组织内PPO活性高于纳米硅和硅酸钠处理。

表油菜素内酯诱导大白菜抗软腐病研究

试验采用叶面喷施的方法,研究了24-表油菜素内酯(24-Epibrassinolide,EBR)对大白菜软腐病的诱抗作用及其生理机制。结果表明,外源EBR处理大白菜幼苗病情指数明显比对照降低,下降了25.8%;喷施EBR提高了大白菜叶片中H2O2含量,使丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量下降,提高了过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性,过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性先缓慢升高然后下降;接种软腐病菌后,EBR使H2O2和MDA含量缓慢增加,但EBR处理MDA含量低于对照处理,显著提高了CAT活性,POD活性与对照相比下降,呈现缓慢升高趋势;EBR处理明显促进幼苗的生长,即使在接种软腐病菌期间,植株的长势也比对照强。说明EBR通过调节植物体内氧的代谢平衡,增强对软腐病的抗性。

解淀粉芽孢杆菌BGP20-γ的诱变选育及生防效果

胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora,Ecc)引起的细菌性软腐病是导致采后蔬菜腐败的主要原因之一,前期研究发现解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)BGP20对该病害具有较好的生防效果。为了进一步提高BGP20对采后蔬菜细菌性软腐病的生防效果,本研究利用60Co辐照诱变技术,对该菌株进行诱变选育。结果表明,在200-800 Gy剂量范围内,60Co对BGP20的致死率随着辐照剂量的增加而迅速上升。600 Gy剂量的60Co辐照致死率为78.3%,选用该剂量进行诱变选育。利用辣椒对409株突变菌株的生防效果进行活体评价,获得1株生防效果显著提高的突变菌株BGP20-γ(P<0.05)。与野生型菌株BGP20相比,利用突变株BGP20-γ处理的辣椒伤口腐烂面积下降64.4%,其在辣椒伤口上的定殖能力显著提高,将病原菌Ecc的群体数量限制在一个更低的水平。

胡萝卜软腐欧文氏菌中信号分子合成酶expI基因的克隆、表达及其分析

用PCR方法从胡萝卜软腐欧文氏菌的基因组DNA中扩增出信号分子合成酶expI基因,将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28α(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达expI基因的重组大肠杆菌BL21(pET28α-expI)。重组菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约为24.8 kD,与预期分子量相符。经薄层层析和高效液相色谱分析发现该重组菌产生的信号分子种类为N-3-羰基己酰高丝氨酸内酯和N-己酰高丝氨酸内酯与胡萝卜软腐欧文氏菌产生的一致。

彩色马蹄莲欧文氏菌PCR检测

采用聚合酶链式反应(PCR)技术检测彩色马蹄莲欧文氏菌纯培养和彩色马蹄莲样品,并用分离培养技术加以验证。结果表明,PCR能特异地检测出所有10个彩色马蹄莲欧文氏菌菌株,并证实了昆明地区侵染彩色马蹄莲的细菌为胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)。PCR与分离培养技术检测结果基本一致,但总体上PCR检测阳性率稍高于分离培养检测的发病率。接种马铃薯、大白菜24h后接种点处均出现明显软腐症状。该项技术具有更高的灵敏度,适用于彩色马蹄莲种苗的检测和病害流行学研究。

大白菜抗软腐病性状的SRAP标记分析

以大白菜高抗软腐病的自交系A32-2和感病自交系A19-2进行杂交的F2代225个单株作为构建遗传图谱的作图群体,采用SRAP标记方法构建了包含10个连锁群,由103个SRAP遗传标记组成的大白菜分子遗传图谱,该图谱覆盖长度为1223.6cM,平均图距11.9cM。运用软件Windows QTL Cartographer V2.5和复合区间作图法共检测到4个抗软腐病的QTL位点。

几种杀菌剂对黄瓜细菌性斑点病及大白菜软腐病的抑制作用

采用抑菌圈法和含毒介质法测定几种杀菌剂对黄瓜细菌性斑点病和大白菜软腐病的抑制作用。结果表明,抑菌效果较好的为农用链霉素、新植霉素和水合霉素;丙森锌对黄瓜细菌性斑点病较好,而对大白菜软腐病则较差;氢氧化铜、噻菌铜及中生菌素抑制作用一般;春雷霉素抑菌活性较差。

细菌凝集素与菌体脂多糖在大白菜与软腐欧氏杆菌接触识别中的作用

用3种试验方法测定了大白菜细菌凝集素(Agin-SD60)和软腐欧氏杆菌脂多精(LPS),在双方接触识别中的作用。在吸附抑制试验中,来自大白菜和马铃曾的Agin-SD60显示约98％的吸附抑制效应,另3种植物的Agin-SD60及大白菜外源凝集素(lectin)和细咆壁蛋白质(CWP)无明显作用;同时用不同种类的7个菌侏的LPS作测定,只有病菌的LPS吸附抑制作用明显(93.37％),其胞外多糖(EPS)也无作用。在菌体凝集试验中,也只有大白菜和马铃薯的Agin-SD60表现50％～100％的凝集活性。在琼脂双扩散试验中,寄主Agin-SD60可与病菌菌体及其LPS发生免疫沉淀。这些结果说明,Agin-SD60和菌体LPS在大白菜与软幅欧氏杆菌接触识别中分别作为植物识别子(cognor)和细菌识别子(cognon)起作用。

软腐欧文氏菌对大白菜幼根吸附的接种菌量阈值

用9种含菌量的菌悬液接种大白菜幼苗根系,分别检测病菌对幼根各分区表面的吸附菌量,估计出了病菌对根不同分区表面吸附所需的接种菌量阈值(菌悬液含菌量低限),为研究吸附性质和机制打下了基础。

胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种Ecb菌株表达的一种Harpin蛋白

1986年,hrp基因被首次报道。由于Wei等（1992）从梨火疫病菌（Brwinia amylovora）中分离出了能激发过敏反应的HarpinEa蛋白,细菌所产生的Harpin分子受到了同行的重视。基于对Harpin蛋白的深入研究,国外已研制出了相关新型、高效、安全的生物农药。近年来,国内涉及Harpin蛋白结构与功能的研究课题组逐年增多,并在某些方面取得了较好的进展。

欧文氏杆菌铁代谢相关基因的生物信息学分析

利用生物信息学软件对欧文氏杆菌(Erwinia carotovora subsp.atroseptica)基因组中与铁代谢相关的基因进行生物信息学分析。结果表明,共筛选到71个与铁代谢相关的基因,其中,有51个为已知功能基因,20个为推测功能基因。在获得的71个基因中,12个基因参与铁载体合成、27个基因与Fe3+吸收有关、3个基因与Fe2+吸收有关、10个基因与亚铁血红素吸收有关、1个基因与编码贮铁蛋白有关、7个基因与铁吸收调控有关、还有11个基因可能与铁代谢有关。

大白菜软腐病菌游动性突变体在大白菜体内增殖扩展研究

用培养皿滤纸吸附测定法和不伤根土壤拌菌处理及针刺接种法 ,测定了大白菜软腐病菌游动性突变体进入大白菜体内、并在其中侵染定殖和扩展的特性。结果表明 ,游动性丧失和增强的突变体都可以通过种子萌发和主动接触进入大白菜体内、并可以在体内有短期的繁殖 ,但菌量远低于野生菌。大白菜叶片接种实验说明 ,这两种突变体也都可以进行短距离扩展 ,但扩展距离和菌的繁殖量低于野生菌。

胡萝卜软腐欧文氏菌CSSY002菌株hrpN基因的克隆、鉴定及其表达产物Harpin蛋白的活性分析

从感染软腐病的胡萝b组织中分离出胡萝卜软腐欧文氏菌胡萝b亚种（ Erwinia carotovora subsp, carotovora）CSSY002菌株．用该菌株接种非寄主植物烟草不能引起过敏反应．构建CSSY002菌株的基因组文库，应用α-P^32标记的hrpN基因作探针，通过菌落原位杂交技术从该文库中筛选到1．5～2．0 kb的hrpN-like阳性克隆，进一步将该片段亚克隆到pBluescript—II SK（＋）载体中，进行核苷酸序列测定．结果表明，hrpN-like基因（即hrpNCSSY002基因）的开放阅读框（ORF）为1071bp，其核苷酸序列已在Genbank注册，登录号为bankit AY999002．hrpN-like基因的编码产物Harpin—like蛋白（即HarpinCSSY002蛋白）由356个氨基酸残基组成，分子量为36．64×10^3，等电点pI5．9．将hrpN—like基因构建到表达质粒pET-28a（＋）的17强启动子下，并转化到大肠杆菌工程菌JM109（DE3）细胞中，经WTG（异丙基硫代-β-D半乳糖苷）诱导获得Harpin-like蛋白的高效表达，并通过接种烟草叶片的过敏反应检测Harpin—like蛋白的生物学活性．

甜瓜细菌性软腐病病原鉴定

近年来,浙江义乌等地的甜瓜(CucumismeloL.)果实上普遍发生一种外观褐色小斑,果肉水渍状腐烂现象,局部田块发病率高,损失严重。为确定病原,从病果上分离到4个细菌菌株,分别定名为M1、M2、M3和M4。烟草过敏性反应和致病性测定表明M2和M4不具致病性,而M1和M3在烟草上能引起典型的过敏性坏死反应,接种甜瓜24h内即导致果实的明显腐烂,所引起的腐烂症状与田间发病果实一致。对M1和M3进行培养性状、革兰氏染色、形态学和鞭毛观察、马铃薯薯块腐烂试验,以及16SrRNA基因测序和比较,结果证明该病害是由软腐欧氏杆菌软腐亚种Erwiniacarotovorasubsp.carotovora引起。

EcbCSL101菌株hrpN基因的克隆、表达及HarpinEcbCSL101蛋白的生物学活性

胡萝卜软腐欧文氏菌甜菜亚种(Erwinia carotovora subsp.betavasculorum)EcbCSL101菌株具有很强胞外酶分泌活性,接种非寄主植物烟草引起过敏反应。Southern blotting结果表明EcbCSL101菌株中含有hrpN基因。PCR扩增含EcbCSL101完整开放阅读框的DNA片段并克隆到表达载体pET28a(+)中。核苷酸序列分析表明,EcbCSL101菌株的hrpN基因的ORF为1113bp,编码36.65 kD HarpinEcbCSL101蛋白(GenBank,DQ355519),与其它几种软腐欧文氏菌Harpin蛋白有较高的同源性。将含有hrpNEcbCSL101基因的重组质粒转化到大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达,纯化后的HarpinEcbCSL101能诱导烟草发生过敏反应。

胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜亚种游动性突变体的筛选

用转座子 Tn5对胡萝卜软腐欧氏杆菌胡萝卜亚种 ( Erwinia carotovora subsp.carotovora,Ecc)进行诱变 ,获得 9个游动性改变了的突变体。 M4 32游动性变大 ;M143、M4 51和 M574游动性完全丧失 ;M4 3、M4 9、M330、M72 5和 M72 6游动性较野生型变小。这 9个突变体在大白菜叶柄上的致病力均减弱。游动性变小或丧失的突变体鞭毛数目减少或未发现有鞭毛。

魔芋内生细菌抗软腐病菌株筛选

通过组织分离法从魔芋块茎中分离得到内生细菌,用牛津杯法皿内测试内生细菌对魔芋软腐病菌的拮抗作用,以筛选拮抗软腐病菌能力强的菌株。结果显示从魔芋块茎中分离得到35株内生细菌,35株内生细菌对魔芋软腐病菌均有不同程度的拮抗活性,不同菌株间拮抗活性存在显著差异。初筛中,对软腐病菌相对抑制率(RIR)达到50%以上的内生细菌有17株,100%的有11株。复筛中RIR为100%的内生细菌有8株,其中7株胞外产物的RIR超过了150%。

氯溴异氰尿酸防治几类主要病害药效研究

本文研究了新型杀菌剂氯溴异氰尿酸对不同类型病害的防治效果。结果表明:该药剂对白菜软病、黄瓜霜霉病利烟草病毒病均有一定防效。