刺桐胰蛋白酶抑制剂亲和层析填料的制备及应用

研究用交联琼脂糖为载体 ,三聚氯氰为活化剂 ,刺桐胰蛋白酶抑制剂为配基 ,制备亲和填料的方法 .通过紫外和红外光谱分析 ,对制备的填料进行表征 .用制备的亲和填料吸附重组人组织型纤溶酶原激活剂突变体(reteplase,r- PA) ,研究吸附与解吸附条件 .结果表明 ,用该方法制备的亲和填料 ,制备工艺简单 ,吸附性能良好 ,对r- PA的吸附量为 8.76 mg· g- 1 .解吸附完全 ,不影响活性 ,可以用来分离纯化 r- PA.

刺桐胰蛋白酶抑制剂基因的构建及表达研究

刺桐胰蛋白酶抑制剂是胰蛋白酶、组织型纤溶酶原激活剂及瑞替普酶特异性的抑制剂 ,可作为配基制成亲合填料用于纯化上述酶。通过化学合成和PCR结合法合成了ETI基因 ,经过序列分析后将其克隆到大肠杆菌表达载体质粒pET32a中 ,并在大肠杆菌中进行诱导表达。表达蛋白分子量同理论值一致 ,生物活性检测表明复性后的ETI对胰蛋白酶及瑞替普酶具有特异抑制作用。

单分散非多孔交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球作为亲和色谱载体的研究

单分散、非多孔聚甲基丙烯酸环氧丙酯微球机械强度高，表面的环氧基易于修饰与键合，非常适宜于生物大分子的快速分离、纯化。对其表面环氧基浓度、非特异性吸附性能等进行了表征；并以胰蛋白酶抑制剂为配基，制备了胰蛋白酶抑制剂．交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯亲和色谱柱，考察了胰蛋白酶等蛋白质的亲和色谱行为，表明该基质适宜用作亲和色谱载体。提出以添加1％乙腈的方法，可有效地消除此类载体的弱非特异性吸附，使人血清白蛋白的回收率＞99％。

壳聚糖多孔珠作为亲和吸附剂载体纯化人尿胰蛋白酶抑制剂

UTI粗品经壳聚糖多孔珠 胰蛋白酶亲和层析 ,得到比活为 135 0U/mg ,收率为 40 .2 %UTI组分。再经SephadexG 10 0凝胶过滤 ,发现存在四种分子形式 ,其相对分子质量分别为 6 70 0 0 ,43 0 0 0 ,2 3 0 0 0 ,16 0 0 0。其中 ,16 0 0 0的无UTI活性。

人尿激肽原酶的纯化与鉴定

采用两性离子胶体沉淀和乙醇沉淀相结合的粗提方法,经离子交换、疏水层析、亲和层析及凝胶过滤 4个步骤有效地将人尿激肽原酶(hk 1)粗提物纯化,比活提高了 175 5倍,总得率为 70 %.用以慈菇蛋白酶抑制剂为配体的亲和层析纯化hk 1,效果理想,整个工艺路线适合产业化生产.纯化产物在SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳上为单带,高压液相色谱(HPLC)上为单峰,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测得分子质量为 3345 0u,等电聚焦测得pI在 4 3附近,为含糖蛋白.同时测定了该酶的热稳定性和pH稳定性.纯化过程中同时分离得到另一种药用蛋白———人尿胰蛋白酶抑制剂(HUTI).

人尿胰蛋白酶抑制剂的快速纯化

目的以人尿浓缩物为原料 ,对人尿胰蛋白酶抑制剂的分离纯化技术进行研究。方法利用纯胰蛋白酶作为配体偶联于CNBr Sepharose 4B为亲和载体 ,在不同条件下洗脱亲和蛋白 ,可从粗品溶液中快速分离纯化具有胰蛋白酶抑制活性的两种纯产物。结果层析图谱与SDS PAGE分析表明 ,根据洗脱条件 ,可将有抑制活性的 2 0kD和 40kD蛋白质分离为两个单独组份或混合物。其中 2 0kD组份的抑制活性回收为 35 % ,抑制比活为 3 387U/mg;40kD组份的相应值分别为 5 3 %和 3 116U/mg。混合物的抑制活性回收和抑制比活分别为 89%和 3 0 76U/mg ,再经Su perose 12或Superdex 75凝胶渗透层析 ,分别获得两种组份的纯产物。 结论通过选择性洗脱亲和柱 ,可快速获得高收率。

人尿胰蛋白酶抑制剂的分离纯化

人尿经吸附剂处理，硫酸铵沉淀后，得到胰蛋白酶抑制剂（ＨＵＴＩ）粗品。粗品经ＤＥＡＥ－ＳｅｐｈａｄｅｘＡ－５０层析及ｔｒｙｐｓｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析，得到两种ＨＵＴＩ：ＨＵＴＩ１与ＨＵＴＩ２。ＨＵＴＩ１的比活为３５５６ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，活性回收率为３５％，含分子量６７０００与２５０００两种组分；ＨＵＴＩ２的比活为３３８５ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，活性回收率为３１％，分子量为６７０００。经二步层析纯化，纯化因子达１１．３，而粗品直接上亲和柱所得半纯品的比活为１７０７ｕｎｉｔｓ／ｍｇ，活性回收率为４２％，纯化因子５．５。

刺桐胰蛋白酶抑制剂亲和填料的制备及纯化瑞替普酶

刺桐属胰蛋白酶抑制剂 (ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂 ,能特异性的抑制胰蛋白酶、组织纤溶酶原激活剂 (t PA)、瑞替普酶 (r PA)等丝氨酸蛋白酶。实验利用ETI工程菌 ,经诱导表达、体外复性及纯化获得ETI蛋白 ,并将该蛋白键合到CNBr活化的琼脂糖凝胶 ,制备ETI亲和填料 。

人尿胰蛋白酶抑制剂中间品的纯化

人尿胰蛋白酶抑制剂是一种可药用的生物制品，人尿胰蛋白酶抑制剂的粗品经过超滤，离子交换层析和亲和层析三步纯化，获得人尿胰蛋白酶抑制剂的中间品，其效价由原来的１０ｉｕ／ｍｇ纯化到２２４０ｉｕ／ｍｇ，比活为２４５０ｉｕ／ｍｇ蛋白质。活性回收率为５８％

补骨脂胰蛋白酶抑制剂的亲和层析分离纯化和部分性质

本文介绍牛胰蛋白酶—对氨基苯砜乙基(ABSE)—Sepharose—4B的制备,及用此亲和吸附剂分离提纯补骨脂胰蛋白酶抑制剂的过程。用该方法对补骨脂胰蛋白酶抑制剂粗提物进行分离,可获得电泳单点纯样品。经SDS—PAGE电泳测定,该抑制剂的分子量为55000。等电聚焦电泳测定其等电点为pⅠ6.6,Chiff试剂染色为阴性。氨基酸组成分析結果表明含12种氨基酸,其中Gly、Glu含量最高。

改性甲壳素固定化胰蛋白酶直接纯化牛肺Kunitz抑制剂的研究

通过对天然甲壳素 (或壳聚糖 )进行化学改性并修饰作为载体 ,再经氯代环氧丙烷活化偶联 ,制成固定化胰蛋白酶亲和吸附剂 (蛋白酶偶联率为 6 2 1% ,酶活性回收率为 5 7 8% ) ,直接亲和层析牛肺提取液中Kunitz抑制剂。纯化的产品每毫克蛋白酶抑制剂活力相当于 5 82 0BAEETTU/mg蛋白质 ,纯化率为 40 7。提高了Kunitz抑制剂的稳定性能和回收率 ,简化了工业化生产程序 。

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的制备及活性鉴定(英文)

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种Kunitz型胰蛋白酶抑制剂,能够抑制胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂的活性,因此ETI可以作为配体与固定相偶联用于亲和层析.利用化学合成及聚合酶链式反应(PCR)的方法获得ETI的编码基因,然后用NdeI/SacI酶切并插入载体pET25b ( +)中构建重组表达质粒pET25b ( +)/ETI .重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG诱导使重组ETI(rETI)过量表达形成包涵体.包涵体经过洗涤、复性及CM离子交换柱纯化,每升培养液可获得14 mgrETI ,其纯度超过92 %.活性测定表明,rETI对凝血酶及尿激酶的活性没有抑制作用,但能显著抑制胰蛋白酶、瑞替普酶及纤溶酶的活性,抑制常数Ki分别为5 .14×10-9,9 .4×10-8和2 .08×10-8mol/L.

重组刺桐胰蛋白酶抑制剂的复性纯化

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,可抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及组织纤溶酶原激活剂(t-PA)等。本研究利用大肠杆菌高密度发酵表达ETI,产物以包涵体形式存在,经体外以脉冲稀释的方式复性并纯化后,每升发酵液可得ETI1000mg以上,纯度大于95%,比活为1.55IU/mg。ETI制成的ETI-Sepharose亲和胶,每ml可吸附重组瑞特普酶融合蛋白(Trx-rPA)2mg,可应用于制备t-PA及其衍生物如r-PA等药用蛋白。

苦荞胰蛋白酶抑制剂的纯化及特性研究

利用固相胰蛋白酶亲和色谱及离子交换色谱,从苦荞种子中分离纯化了三个具有抑制胰蛋白酶活力的组份(BTI-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)。经聚丙稀酰胺凝胶等电聚焦测定,三种抑制剂的等电点为6.87,6.7,5.14。根据Sephadex G-75凝胶过滤,SDS-PAGE测定,以及由当量抑制比值和氨基酸组份的推算,它们的分子量范围分别为5200-5700(Ⅰ),5500—6000(Ⅱ),5000—5600(III)。三者对胰蛋白酶的抑制常数分别为2.12×10^(-8),4.78×10^(-9),1.22×10^(-8)。氨基酸分析结果表明,它们均含有很高的极性氨基酸。在酸性条件下,它们均具有很高的热稳定性。化学修饰的结果表明,它们活性中心的氨基酸残基为Lys。

苦荞胰蛋白酶抑制剂的研究

苦荞粉经缓冲液提取后,用Trypsin-SESA-Sephadex G-75亲和色谱分离纯化,得到苦荞胰蛋白酶抑制剂,此抑制剂进一步在CM-52,DEAE-52上分离纯化,得到五个组份。对其中三个主要组份(BTI-Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ)的研究表明,它们的消光系数(E_(1cm)^(1％) 280nm)分别为4.1,4.8和7.8,最大吸收光谱分别为280nm,274nm和277nm。纯化倍数达160-167倍。它们在酸性条件下均具有很高的耐热性,其中以BTI-Ⅱ的热稳定性最高。用纯化后的BTI-Ⅱ作配基,制成Trypsin inhibitor-SESA-Sephadex G-75亲和吸附剂,可用于纯化胰蛋白酶。

刺桐胰蛋白酶抑制剂的高效表达、纯化、亲和介质的制备及其在r-PA纯化中的应用

刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,能够特异性结合胰蛋白酶及组织型纤溶酶原激活剂,抑制其活性。因此ETI可以作为配体与固定相偶联制备亲和层析介质,用于tPA(组织型纤溶酶原激活剂)及其突变体的纯化。利用基因工程方法构建了ETI的高表达工程菌株,诱导表达后目的蛋白占总蛋白的39.6%,经包涵体变性、复性、纯化,制备了纯度高于96%的ETI样品,收率达到了63.5%。利用纯化的ETI,偶联制备了亲和层析介质,偶联率达到99%。用制备的ETI亲和层析介质纯化瑞替普酶(r-PA),获得的r-PA样品纯度高于95%,生物学活性高于5×105U/mg。本研究为ETI的进一步生产及应用奠定了基础。

一种胰蛋白酶亲和材料的制备及应用

基于抑制剂与酶的特异亲和作用,将具有良好稳定性的荞麦胰蛋白酶抑制剂(Buckwheat trypsin inhibitor,BTI)固定化,制备成一种胰蛋白酶的亲和吸附剂,实现胰蛋白酶的高效纯化。通过原核表达、Ni2+-NTA亲和层析和Superdex G-25凝胶过滤技术得到电泳纯的BTI,以溴化氰活化琼脂糖凝胶(CNBr-Sepharose CL-4B)作为亲和层析载体,制备亲和吸附剂BTI-Sepharose,检测其对胰蛋白酶的特异性吸附作用,并进一步研究BTI-Sepharose对胰蛋白酶吸附及解吸附的条件。制备的BTI-Sepharose对胰蛋白酶具有特异吸附性,可用于胰蛋白酶的亲和纯化。缓冲液p H对BTI-Sepharose与胰蛋白酶的吸附及解吸附均有重要影响,二者吸附作用的最适pH为7.2,在pH为3.5时两者能够完全分离,且不影响胰蛋白酶的生物活性。试验制备的BTI-Sepharose可实现一步层析制备高纯度胰蛋白酶,为胰蛋白酶的高效纯化及新型胰蛋白酶的研究开发提供理论依据。