大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆、表达与缺失

利用途径工程的基本原理 ,拟在大肠杆菌核苷酸代谢途径中构建腺苷 (AR)转化为腺苷三磷酸 (ATP)的新途径 ,故需使细胞内的腺苷脱氨酶基因 (add)缺失。通过构建大肠杆菌MC41 0 0DNA的基因文库 ,筛选得到含腺苷脱氨酶基因的DNA片段。构建表达质粒pBD1和pBD2并实现了表达。在此基础上构建了add基因缺失的带卡那霉素抗性基因的线性 5 2kbDNA分子 ,同时转化JM83、MC41 0 0、BL2 1 (DE3 )。经遗传稳定性实验和DNA分子杂交鉴定 ,确认得到了来自JM83的两株add基因缺陷株J1和J2。再对菌株J1、pUC1 8/JM83、pBD1 /JM83的细胞粗提液做腺苷脱氨酶的酶活鉴定比较 ,结果表明则没有腺苷脱氨酶活性 ,pBD1 /JM83有比pUC1

大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆表达

将大肠杆菌K12菌株来源的腺苷脱氨酶基因(add)克隆到载体pET-28a中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。通过IPTG诱导,SDS-PAGE检测和酶活性的测定发现,重组菌表达产生大量腺苷脱氨酶,活性达到51.07U/mg蛋白。通过酶性质的研究,腺苷脱氨酶对腺苷最适pH和温度分别为7.5和40℃,且在40℃下维持稳定。