重组大肠杆菌表达水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白

旨在通过现代分子生物学技术制备水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白。以水稻白叶枯病菌总DNA为模板,采用巢式PCR方法扩增获得水稻白叶枯病菌fts Z基因,构建fts Z基因的表达载体p ET-22b-ftsZ,转化表达宿主E.coli BL21后,经PCR、Nde I/Xho I双酶切及测序鉴定、阳性克隆子经IPTG诱导表达,融合蛋白经镍柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定。结果显示,水稻白叶枯病菌ftsZ基因的重组表达载体构建成功,且阳性克隆子在IPTG的诱导下表达了Fts Z-6×His融合蛋白,并通过镍柱纯化获得了电泳纯的Fts Z-6×His融合蛋白。

大肠杆菌Fts Z蛋白原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

为制备特异性抗大肠杆菌丝状热敏蛋白Z(Escherichia coli filamentous thermosensitive protein Z,Ec-FtsZ)多克隆抗体,将Ec-FtsZ基因进行化学合成后连接pET-22b(+)表达载体,构建重组质粒Ec-FtsZ-pET-22b(+)。将重组质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行Ec-FtsZ原核表达与表达条件优化,以HisTrap层析柱进行Ec-FtsZ的分离纯化,再以孔雀绿法进行Ec-FtsZ GTPase(Guanosine triphosphatase)活性测定。使用纯化的Ec-FtsZ为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体,经酶联免疫吸附测定实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、Western blotting实验和免疫荧光实验鉴定,抗Ec-FtsZ多克隆抗体效价可达1∶256 000且具有良好的抗原特异性。抗Ec-FtsZ多克隆抗体的成功制备为Ec-FtsZ生物学功能研究和生化检测奠定了实验基础。