冻干奶粉样品中大肠杆菌O157和O111的检测方法

应用实时荧光PCR技术建立一种检测冻干奶粉样品中大肠杆菌的方法。通过传统培养法将大肠杆菌O157和O111分离纯化,根据大肠杆菌O157和O111的两对特异性基因rfbE和wbdl设计引物和探针,进行RT-PCR检测;由于该大肠杆菌可能是产志贺毒素大肠杆菌,对STEC的特异性毒力基因stx1、stx2b、eae设计引物和探针并检测。结果表明,该冻干奶粉样品中含有大肠杆菌O157和O111,且致病菌O157检出毒力基因stx1、stx2b、eae,即产志贺毒素与黏附素,致病菌O111检出毒力基因eae,不产志贺毒素而产黏附素。该方法能准确分离大肠杆菌O157和O111,利用实时荧光PCR的高灵敏度和特异性快速检验致病菌及其特异性毒力基因。

大肠埃希氏菌O157和O111能力验证样品的研制

目的研制植物源性成分绿豆基质中O157和O111检测能力验证样品,建立有效的样品制备流程来考核实验室检测致泻大肠埃希氏菌O157和O111的能力,根据参加实验室检测结果是否准确及可靠来评价实验室检测水平,并促进实验室检测体系进一步完善。方法选用O157和O111的ATCC标准菌株制备样品,以绿豆粉为基质,真空冷冻干燥技术制备样品。采用显色培养基、荧光定量PCR、全自动细菌生化鉴定仪、VIDAS全自动免疫荧光分析仪和血清型鉴定进行定性检测,并进行菌落计数。结果随机选取每一批阳性样品中的30个样品,每个样品中目标菌数在21~60 CFU之间,并且A组与B组阳性样品中均检测出目标菌,而阴性样品中均没有出现目标菌。结论表明采用本方法制备的能力验证样品均一稳定,能较好地评价实验室致泻大肠埃希氏菌O157和O111的检测能力。

大肠埃希菌O_(111)黏附牦牛子宫内膜上皮细胞致炎模型的建立

为建立大肠埃希菌O_(111)黏附牦牛子宫内膜上皮细胞的致炎模型,体外分离、培养牦牛子宫内膜上皮细胞,培养5d后,加入大肠埃希菌O_(111),通过计算细胞上细菌的黏附数量研究细菌数量和孵育时间对黏附效果的影响,得到最佳黏附条件,通过ELISA法测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL^(-1)β)的质量浓度变化来鉴定模型。结果表明,大肠埃希菌为1×10~5 CFU/mL、孵育时间为120min是黏附的最佳条件。ELISA法检测结果表明,与对照组相比,60、90、120min组TNF-α、IL-6、IL^(-1)β的质量浓度显著升高,致炎效果明显,表明致炎模型建立成功。

抗内毒素核心糖脂抗体大肠杆菌J5株免疫血清的制备

目的 探讨制备高效价抗内毒素核心糖脂 ( E.Coli J5 )抗体 ,为免疫治疗革兰阴性菌 ( GNB)菌血症和感染性休克奠定基础。方法 应用大肠杆菌 O111:B4变异株 ( J5 )制备无毒菌苗 ( 5 0× 10 1 2 / L )。12只家兔经耳缘静脉注射 J5菌苗 (另 12只用生理盐水作对照 ) ,每 3d注射 1次 ,共 5次 ,每次剂量依次为 0 .1、0 .2、0 .4、0 .6和 0 .8ml。第 5次注射后 1周由心脏取血 4 0～ 5 0 m l,分离血清 ,采用间接血凝法测定抗体效价及交叉反应试验。结果 12只免疫家兔中 ,6只抗体效价在 1∶ 10 2 4以上 ,并与多种 GNB内毒素产生交叉反应。结论 自制的 E.Coli J5抗体效价高 ,可与多种