E.coli O78和LAB对牦牛肠道上皮细胞MAPK/Zonulin通路的影响

为探究牦牛致病性大肠杆菌(E.coli O78)和乳酸杆菌(LAB)对牦牛肠道上皮屏障MAPK/Zonulin通路的影响作用,采用牦牛上皮细胞作为实验模型,Transwell构建单层上皮细胞屏障,设立阴性对照组(Control组)、阳性对照组(Model组,加入1×10^(5)CFU E.coli O78)、低剂量组乳酸杆菌组(LLAB组,加入1×10^(5)CFU E.coli O78和1×10^(5)CFU LAB)、高剂量乳酸杆菌组(HLAB组,加入加入1×10^(5)CFU E.coli O78和1×10^(7)CFU LAB),采用RT-qPCR和Western-blot技术测定各组P38、ERK、JNK、Zonulin的基因和蛋白表达水平。结果:与Control组相比,Model组的P38、ERK、JNK、Zonulin的基因表达水平极显著上升(P<0.01),而其蛋白表达水平呈现显著上升的趋势(P<0.05);与Model组相比,LLAB组P38的基因表达水平极显著下降(P<0.01),ERK、JNK、Zonulin的基因表达水平表现显著下降的趋势(P<0.05),P38、ERK、Zonulin的蛋白表达水平则呈现极显著下降的趋势(P<0.01),JNK的蛋白表达水平表现为显著下降(P<0.05);与Model组相比,HALB组P38、ERK、JNK的基因的表达水平表现为显著下降(P<0.05),Zonulin的基因表达水平表现为极显著下降(P<0.01),P38、ERK、JNK、Zonulin的蛋白表达水平呈现极显著下降的趋势(P<0.01)。结论:E.coli O78可通过上调MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的基因表达水平,同时上调Zonulin蛋白使肠道屏障受损;LAB可以减轻E.coli O78引起的肠道屏障受损,这一作用是通过下调MAPK通路关键基因P38、ERK、JNK的基因表达水平,同时下调Zonulin蛋白表达水平来实现的。

黄芩汤及其减味方颗粒对感染大肠杆菌O78雏鸡肠道菌群和炎性反应相关性的影响

本试验以黄芩汤及其减味方颗粒饲喂人工感染大肠杆菌O78雏鸡后,研究肠道菌群与溶菌酶、炎症因子及Toll样受体间的相关性。首先,制备黄芩汤及其减味方颗粒,然后将19日龄伊莎褐雏鸡随机分为空白对照组(CG)、模型组(MG)、黄芩汤颗粒组(HQT)、黄芩汤减大枣颗粒组(ADZ)、黄芩汤减甘草颗粒组(AGC)、黄芩汤减白芍颗粒组(ASY)、黄芩汤减黄芩颗粒组(AHQ)、恩诺沙星组(ENR),每组10只。5个中草药组饲料中添加相应颗粒剂(500 mg/kg·BW)、恩诺沙星组添加量为10 mg/kg·BW,混饲7 d后,除空白对照组,其余7组的每只鸡胸肌注射0.6 mL大肠杆菌O78菌液,继续混饲5 d。试验结束后,16S rDNA测序法测定肠道菌群;ELISA法检测血清溶菌酶和炎症因子(IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α)水平;RT-PCR法检测脾脏Toll样受体(TLR4、TLR5、TLR15)相对表达量;采用Pearson法分析其相关性。结果表明:经黄芩汤及其减味方颗粒饲喂染病雏鸡后,其肠道菌群结构与溶菌酶、炎症因子含量及Toll样受体相对表达量间呈现一定的相关性。黄芩汤及其减味方颗粒可通过回调染病雏鸡肠道菌群结构,下调血清中溶菌酶、炎症因子水平以及脾脏Toll样受体相对表达量,从而达到治疗鸡大肠杆菌病的目的。试验结果可为黄芩汤及其减味方颗粒治疗鸡大肠杆菌病分子机制的系统研究提供参考依据。

屎肠球菌NCIMB11181对大肠杆菌O78感染肉鸡生产性能、肠道微生物和血液抗氧化功能的影响

试验旨在研究饲粮添加屎肠球菌对禽大肠杆菌O78感染肉鸡生产性能、肠道微生物菌群和血液抗氧化功能的影响。选取288只1日龄罗斯308母鸡,随机分成4组。分别在各试验组基础饲粮中添加0、100、200、300 mg/kg屎肠球菌。各试验组在11日龄均气囊接种禽大肠杆菌,0.2 mL/只。结果表明:与无添加组相比,(1)饲粮中添加屎肠球菌可线性提高10日龄肉鸡体重(BW)(P<0.05),线性及二次线性提高22和35日龄肉鸡BW(P<0.05),线性提高1~10、10~22和10~35日龄肉鸡平均日增重(P<0.05),降低感染后肉鸡死亡率。(2)饲粮中添加屎肠球菌可线性降低感染后3 d盲肠大肠杆菌和沙门菌数量(P<0.05),线性及二次线性降低双歧杆菌数量(P<0.05);感染后7 d,屎肠球菌添加组大肠杆菌和沙门菌数量线性降低(P<0.05)。(3)感染后3和7 d,屎肠球菌组血清总抗氧化能力分别呈线性(P<0.05)和二次线性降低(P<0.05);血清丙二醛含量均呈线性及二次线性降低(P<0.05);谷胱甘肽过氧化物酶活性均为二次线性降低(P<0.05)。由此可见饲粮添加屎肠球菌可缓解禽大肠杆菌O78感染导致的肉鸡生产性能下降,通过调节肠道菌群结构和机体氧化状态,来减轻大肠杆菌感染造成的生理失衡。提示饲粮添加200 mg/kg屎肠球菌可有效预防肉鸡大肠杆菌O78感染。

鸡大肠杆菌O78对喹诺酮类药物高耐药株的分子鉴定

就临床分离的鸡大肠杆菌O 78对喹诺酮类药物的最低抑菌浓度(M IC)进行了测定,得到对喹诺酮类药物有不同耐药水平的细菌23株。根据G enB ank已公布的QRDR s序列,设计了分别扩增gyrA、gyrB、parC和parE基因的4对引物,以筛选的23株耐药菌DNA为模板,进行了PCR扩增。序列分析及A crA的W estern b lotting检测结果表明,临床分离的鸡大肠杆菌对喹诺酮类药物的耐药水平与G yrA和ParC的突变密切相关,而A crAB外输泵的表达水平无显著变化。提示临床分离的鸡大肠杆菌O 78的耐药水平与喹诺酮类药物的选择性压力有关,它诱导了DNA旋转酶和拓扑异构酶IV的基因突变,可能不能激活A crAB外输泵。

乳酸链球菌素与大黄联合作用对牛源致病性Escherichia coli O_(78)的抑菌作用

为研究乳酸链球菌素(nisin)和大黄联合药效对牛源致病性大肠杆菌的抑菌作用,通过二倍稀释法测定nisin、大黄、抗生素及联合用药的最小抑菌浓度(MIC);微板法测定各药物MIC剂量下致病性大肠秆菌的生长曲线、碱性磷酸酶(AKP)以及总蛋白含量。结果表明:1)nisin单独使用对Escherichia coli O_(78)无抑菌效果;大黄单独使用时MIC为62.5mg/mL,抗生素的MIC为0.016mg/mL,nisin和大黄联合使用MIC分别为0.333和10.417mg/mL。2)大黄和nisin联合药效,能够有效抑制E.coli O_(78)的生长,缩短对数期,效果优于大黄组(P<0.05),仅次于抗生素组(P<0.05)。3)nisin和大黄联合使用对E.coli O_(78)的细胞壁和细胞膜有很强的破坏性,导致AKP和菌体总蛋白指数的升高,效果显著优于抗生素、大黄(P<0.05)。由此可见,大黄和nisin联合作用E.coli O_(78)时,杀菌效果高于抗生素、大黄,抑菌效果高于大黄,但低于抗生素。

五谷虫蛋白粗提液对牛源致病性Escherichia coli O_1和E.coli O_(78)体外抑菌作用

为研究五谷虫蛋白粗提液对Escherichia coli O_1和E.coli O_(78)的体外抑菌作用,采用试剂盒测定五谷虫粗提液蛋白含量;牛津杯法测定蛋白粗提液对牛源病源性E.coli O_1和E.coli O_(78)的抑菌圈直径;通过二倍稀释法测定蛋白粗提液对2种细菌的最低抑菌浓度(MIC);平板法测定最低杀菌浓度(MBC);酶标比浊法测定粗提液对2种细菌的24h生长曲线、细胞膜通透性以及碱性磷酸酶(AKP)的含量。研究表明:1)五谷虫蛋白粗提液蛋白质量浓度为0.680mg/mL;粗提液对E.coli O_1和E.coli O_(78)的抑菌圈直径分别为(25.09±0.62)和(20.96±0.48)mm,MIC分别为15.625和31.250mg/mL,MBC为62.5和125mg/mL,传统中药水煎剂和提取缓冲液没有体外抑菌效果。2)粗提液能影响E.coli O_1和E.coli O_(78)的生长曲线,增加细菌细胞膜和细胞壁通透性。由此可见,蛋白粗提液对E.coli O_1和E.coli O_(78)均有体外抑菌效果,且对E.coli O_1的体外抑菌效果优于E.coli O_(78)。

12味中药对鸡血清型O_(78)大肠杆菌的抗菌活性观察

本研究旨在观察乌梅、芦荟等12味中药的水煎液对鸡致病性大肠杆菌O78的抗菌活性。选取乌梅、芦荟等12味中药加水煎煮以获得中药水提取物,测定其对鸡致病性大肠杆菌O78的最低抑菌浓度(MIC)与最小杀菌浓度(MBC),并对体外抑菌效果较好的单味中药进行体内试验。乌梅、芦荟、白头翁抗菌活性较好,桔梗、连翘、大黄、白芍、白术几乎无抗菌活性,其中乌梅、白头翁与芦荟水提取物对鸡致病性大肠杆菌O78的MIC分别为2.57、2.06和2.31mg/mL。乌梅、芦荟、白头翁具有一定的抗鸡致病性大肠杆菌O78的作用,将为开发新的抗鸡致病性大肠杆菌的药物奠定理论基础。

穿心莲内酯提高异嗜性粒细胞吞噬和杀伤鸡大肠杆菌O78功能的体外试验

模拟大肠杆菌O78在血液中被鸡异嗜性粒细胞吞噬杀伤的过程,利用激光共聚焦和涂板菌落计数的方法研究中药单体成分穿心莲内酯对异嗜性粒细胞吞噬杀伤大肠杆菌O78活性的影响。结果显示,穿心莲内酯质量浓度为1mg/L时有极显著的提高异嗜性粒细胞吞噬大肠杆菌O78的作用(P<0.01),并且在异嗜性粒细胞发挥杀伤作用的12h后有极显著的增强其杀伤作用的功效(P<0.01)。结果表明,穿心莲内酯能够提高异嗜性粒细胞吞噬、杀伤大肠杆菌O78的活性,从而起到增强机体抗病能力,提高机体免疫力的作用。

鸭大肠杆菌O78血清型强毒株分离鉴定及其高密度发酵新工艺

依据大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)持家基因PhoA PCR检测,从临床病料中分离鉴定出11株鸭致病性E.coli。经O抗原血清型鉴定以及毒力分析,筛选出1株O78血清型鸭E.coli强毒株EC-KP120427。以此菌株为基础,使用单因素法以及正交法,获得O78血清型鸭E.coli强毒株新型高密度发酵培养基,配方中初糖采用甘油替代葡萄糖,无机盐仅添加磷酸氢二钾,同时补充铁、锰、铝3种微量元素,在普通摇床上37℃培养菌液D600 nm可达到9.0以上。使用赛多利斯5 L发酵罐,对EC-KP120427菌株进行发酵培养试验。使用优化的新型高密度发酵培养基,按1∶10比例接种对数生长期种子菌,菌液D600 nm值为1.0、控制温度37℃、pH 7.0、调节空气通气量1.5~5.0 L/min、转速100~400 r/min、发酵至对数生长期以15 mL·h-1·L-1流速慢速流加50%葡萄糖溶液,培养菌液D600 nm值可高达30.0以上,成功实现了O78血清型鸭E.coli强毒株高密度发酵。本研究为致病性E.coli高密度发酵技术标准的建立奠定基础,同时为水禽E.coli细菌疫苗的改进提供了技术支持。