基于RNA-seq鉴定金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳房炎的关键应答基因

该研究旨在通过转录组测序技术发掘金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型奶牛乳房炎相关的关键应答基因,为发掘乳房炎防治有关的生物标志物奠定基础。于体外采用金黄色葡萄球菌处理MAC-T建立了金黄色葡萄球菌乳房炎细胞模型,并进行了转录组测序。同时从公共数据库中收集了9份金黄色葡萄球菌和大肠杆菌处理的乳腺上皮细胞转录组测序样本,结合生物信息分析技术进行了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳房炎关键应答基因的发掘。结果发现,乳腺上皮细胞中与金黄色葡萄球菌处理显著关联的差异表达基因有449个,其中上调差异基因有223个,下调差异基因有226个;另有347个差异表达基因与大肠杆菌处理显著关联,其中上调的差异表达基因116个,下调的差异表达基因有231个。功能富集分析发现,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳腺上皮细胞中的差异表达基因主要富集到IL-17信号通路。蛋白质互作分析发现,383个金黄色葡萄球菌型乳房炎特异性差异表达基因形成了21个调控网络,其中最大的调控网络包含了67个差异表达基因。另外,281个大肠杆菌乳房炎特异性差异表达基因形成了16个调控网络,其中最大的调控网络包含了33个差异表达基因。利用Cytoscap插件CytoHubba进一步筛选出金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳房炎的关键应答基因各10个。这些关键应答基因的发掘将为进一步阐明金黄色葡萄球菌和大肠杆菌型乳腺炎的发生发展作用机制奠定基础。

大肠杆菌感染奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺组织致其线粒体损伤的机制研究

旨在探究大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)感染奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺组织致其线粒体损伤的机制。本试验以奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺为研究对象,按试验要求分别随机分成3组:空白对照(Control)组、大肠杆菌(E.coli)组和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)组。Control组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺未被E.coli感染;E.coli组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺被感染复数为5或106 CFU的E.coli感染6或24 h,LPS组奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺经1μg·mL^(-1)或20 mg·kg^(-1)体重LPS处理6或24 h,奶牛乳腺上皮细胞每组3个重复,小鼠乳腺每组6只小鼠。结果表明:1)奶牛乳腺上皮细胞胞浆中角18蛋白被染成绿色且均匀分布在细胞浆内,细胞核被DAPI染成蓝色。2)正常培养的奶牛乳腺上皮细胞内线粒体结构完整,细胞连接紧密;经E.coli感染的奶牛乳腺上皮细胞细胞间隙增大,线粒体肿胀,线粒体嵴缺失且部分模糊消失。3)E.coli感染或LPS处理使小鼠乳腺腺泡内出现中性粒细胞,且使奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺线粒体能量代谢(D(520 nm)吸光值、ATP的含量、线粒体电子传递链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ活性降低)、线粒体的融合与分裂(Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn 2和OPA 1 mRNA表达减少)和线粒体的生物发生(PGC-1α、NRF1、TFAM和D-Loop的基因表达下降)极显著降低(P<0.05,P<0.01)。上述研究表明,E.coli感染主要通过LPS造成奶牛乳腺上皮细胞和小鼠乳腺线粒体能量代谢紊乱、抑制线粒体分裂与融合以及减少线粒体的生物发生,进而造成线粒体损伤,最终导致乳腺炎的发生。因此,确认E.coli感染是通过诱导线粒体损伤造成奶牛乳腺炎,且线粒体损伤可能是造成乳腺损伤的重要原因之一。

大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞bFGF及其受体FGFR2表达的影响

[目的]探讨大肠杆菌(Escherichia coli)对体外培养的奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)b FGF及其受体FGFR2表达的影响。[方法]取热灭活的0、105、106和108CFU/m L浓度的大肠杆菌作用于体外培养的奶牛乳腺上皮细胞,分别在作用后6、12、24和48 h,采用荧光定量PCR和Western blot方法检测b FGF和FGFR2的mRNA和蛋白的表达情况。[结果]b FGF mRNA表达与对照组相比随着大肠杆菌浓度的升高而显著上调(P<0.01),24 h b FGF表达量最高。BMEC b FGF蛋白表达随着大肠杆菌浓度的增加而上调,24 h表达量达到最高;FGFR2 mRNA相对表达量除6 h组外随大肠杆菌浓度的增加而呈现降低、升高、降低的变化趋势,48 h表达量达到最高。各处理组与对照组相比FGFR2蛋白表达随时间的延长、菌液浓度的增加而上调。[结论]大肠杆菌刺激奶牛乳腺上皮细胞可以明显促进b FGF和FGFR2的表达,具有浓度和时间依赖性。

奶牛乳腺源大肠杆菌NJ17 crp基因缺失株的构建及其生物被膜形成能力分析

为探究crp基因对奶牛乳腺源大肠杆菌生物学特性的影响,以奶牛乳腺源大肠杆菌NJ17为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,成功构建NJ17crp基因缺失株(NJ17-Δcrp)。对大肠杆菌野生株NJ17及crp基因缺失株的生长速率和生物被膜形成能力进行检测。结果表明,crp基因缺失影响奶牛乳腺源大肠杆菌NJ17的生长速率,生物被膜形成能力显著降低(P<0.05)。

大肠杆菌对体外培养的奶牛乳腺成纤维细胞TGF-β1和NF-κB及TLR4表达的影响

为研究大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞(BMFB)TGF-β1表达的影响以及对其信号转导通路Toll样受体4(TLR4)的表达和核转录因子κB(NF-κB)活化的影响,采用热灭活的不同浓度大肠杆菌菌液(0、1×105、1×106、1×108 CFU/mL)作用于奶牛乳腺成纤维细胞,分别于不同时间点(作用后第6、12、24、48小时)运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TGF-β1和TLR4mRNA的表达,运用Western-blot检测TGF-β1、TLR4和p-NF-κB-p65蛋白的相对表达量。结果显示,大肠杆菌作用BMFB后,TGF-β1mRNA和蛋白的表达量显著的升高,并且TGF-β1mRNA的表达呈明显的时效及量效关系,于第24小时达到高峰后降低(P<0.05);TGF-β1蛋白的表达量呈量效性(P<0.05)。TLR4mRNA和蛋白表达水平显著升高,并且TLR4mRNA和蛋白的表达呈时效性和量效性,分别于作用后第24和12小时达到最高后逐渐下降(P<0.05)。p-NF-κB-p65的表达与大肠杆菌作用浓度呈正量效关系,表达量随作用时间延长先升高后逐渐降低(P<0.05)。上述研究结果表明,热灭活的大肠杆菌能够促进BMFB的TLR4表达,并激活BMFB p-NF-κB-p65蛋白的表达,从而促进TGF-β1的表达。

奶牛乳腺炎源性大肠杆菌对奶牛乳腺成纤维细胞瘦素及其受体表达的影响

为了研究大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)对奶牛乳腺成纤维细胞(bovine mammary fibroblast, BMFB)中瘦素(leptin, LP)、长型瘦素受体(leptin receptor, OB-Rb)和Ⅰ型胶原蛋白(collagen typeⅠ, COL Ia1)表达的影响,以探讨大肠杆菌感染引起奶牛乳腺纤维化的分子机制,试验用不同浓度(1×10~5 cfu/mL、1×10~6 cfu/mL、1×10~8 cfu/mL)的热灭活E.coli作用于BMFB,并以无血清培养液作为对照组,同时利用qPCR及Western-blot检测LP、OB-Rb和COL Ia1 mRNA及其蛋白的表达水平并进行相关性分析。结果表明:E.coli作用BMFB后,1×10~8 cfu/mL处理组LP、OB-Rb和COL Ia1 mRNA的转录水平与对照组相比显著升高(P<0.05),1×10~8 cfu/mL处理组LP、OB-Rb和COL Ia1蛋白表达水平在24,48小时时显著或极显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)且与作用时间呈正相关。LP与OB-Rb mRNA相关性分析显示,两个因子在12小时时显著相关(P<0.05),其蛋白水平相关性分析显示,两个因子在48小时时极显著相关(P<0.01);LP与COL Ia1 mRNA在6小时时显著相关(P<0.05),其蛋白在24,48小时时极显著相关(P<0.01);OB-Rb与COL Ia1 mRNA在24,72小时时极显著相关(P<0.01),其蛋白在6小时时显著相关(P<0.05)。说明1×10~8 cfu/mL热灭活的E.coli能够促进BMFB中LP、OB-Rb和COL Ia1 mRNA的转录和蛋白表达。