乙酸积累对基因工程菌培养的影响及与培养基pH的关系

在rIL-2工程菌K_(802)(pLY—4)高密度培养中,发现培养液中有大量代谢副产物乙酸积累,乙酸的存在对工程菌的生长和产物的表达均有明显的抑制作用,这种抑制作用是制约工程菌高密度培养的重要因素。为了减小这种抑制作用,初步研究了培养基pH与乙酸抑制作用的关系,发现适当提高培养基pH值,能减小乙酸的抑制作用;高密度培养时,提高培养基的pH后,虽然仍有大量乙酸积累,但产物的表达水平和菌密度都有提高。

pH值对聚唾液酸分批发酵的影响及补料发酵

研究了不同 pH值对聚唾液酸发酵过程中菌体生长和产聚唾液酸的影响 .发酵初期pH自然下降时有利于菌体生长 ,菌体生长对数期较长 ,最大菌体干重可达 6.9g/L ;发酵中后期pH控制在 6.4时有利于聚唾液酸的延续合成 ,合成对数期比其它 pH条件下的合成对数期延长了 1 1h .动力学特性表现为部分相关模式 ,而在其它 pH条件下 ,动力学特性表现为相关模式 .对聚唾液酸的流加补料发酵进行了初步研究 ,最终使菌体干重达到 1 1 .1 6g/L ,聚唾液酸产量达到 2 .60 6g/L .

大肠杆菌CCTCC M208088发酵生产聚唾液酸的pH控制策略

研究了不同pH值控制策略对大肠杆菌CCTCC M208088发酵生产聚唾液酸的影响。采用高浓度磷酸盐培养基(20g/L磷酸氢二钾)缓冲pH值,聚唾液酸产量达到1.9g/L,但大量磷酸盐残留在发酵液中,影响聚唾液酸的后提取处理。把培养基中磷酸盐的质量浓度降至2.5g/L,同时流加2mol/L氢氧化钠溶液控制pH,聚唾液酸产量提升至2.3g/L,但是NH4+在发酵前期16h即消耗完毕。进一步采取氨水流加控制pH策略,聚唾液酸产量提升至3.2g/L,同时菌体浓度大幅增加至12.5g/L,导致40g/L初始山梨醇在20h耗尽。最后,在氨水控制pH的同时,向发酵体系中流加山梨醇,聚唾液酸产量和生产强度分别达到了4.8g/L和0.16g/(L.h),比优化前(高浓度磷酸盐发酵)分别提高了152%和188%。

3-羟基丙酸分批发酵过程中的pH控制策略研究

本文利用重组大肠杆菌以甘油为底物发酵合成3-羟基丙酸,考察了不同pH对3-羟基丙酸产量及茵体生长的影响,发现在pH 6.5条件下,细胞比生长速率达到最大值,延迟期也相对较短;而pH 7.0有利于3-羟基丙酸的合成,控制pH 7.0可以使3-羟基丙酸产量达到7.39 g/L。基于不同pH条件下对细胞比生长速率和3-羟基丙酸比生成速率的分析,提出3-羟基丙酸分批发酵过程中的pH控制策略,即在发酵过程前5 h将pH控制在6.5,5 h^15 h控制pH为7.0,此时有利于细胞生长;而后在15 h^25 h控制pH为7.5,25 h后控制pH为7.0,从而使细胞具有较高的3-羟基丙酸比合成速率。在此控制策略下经过34 h发酵3-羟基丙酸的终产量达到8.76 g/L,比pH 7.0条件下的3-羟基丙酸产量提高了18.54%。

基于pH恒定补糖的生物基丁二酸高效合成

通过确定大肠杆菌在产酸阶段葡萄糖的消耗与酸中和剂碳酸钠间的定量关系,建立了pH恒定补糖策略,能够使发酵液中葡萄糖浓度维持在稳定水平。与分批发酵相比,采用pH恒定补糖且维持葡萄糖浓度在较低的水平对丁二酸的积累是有利的。当采用pH恒定补糖并控制葡萄糖质量浓度在10g/L时,丁二酸最终质量浓度达到57.6 g/L,生产效率达到1.15 g/(L·h)。

重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白Ⅱ的发酵pH优化

为了实现类人胶原蛋白（HLCⅡ）的规模化生产,对重组大肠杆菌BL21 3.7在30 L发酵罐中发酵生产类人胶原蛋白Ⅱ过程中的关键参数pH进行了系统的研究.将发酵过程中pH控制在6.0~7.8之间,监测pH对细胞生长以及类人胶原蛋白Ⅱ的产量的影响,从而确定出合理的pH控制策略增加类人胶原蛋白Ⅱ的产量.由实验数据可得,在pH7.5条件下细胞浓度达到最大,为68.5 g/L,但HCLⅡ的浓度为8.5 g/L.在pH6.8条件下,HLCⅡ浓度达到最大,为10.5 g/L,但其细胞浓度只有60.9 g/L.同时,对发酵过程中代谢副产物有机酸的含量也进行了监测,随着发酵过程pH值的升高,总有机酸的量也相应的增加,当发酵过程pH控制在7.8时,总有机酸达到最大,为15.61 g/L.为了提高目标产物的产量,采用pH两阶段控制策略控制发酵,最终类人胶原蛋白Ⅱ浓度可达到11.3 g/L,较恒pH条件下提高了7.61%.

pH值反馈补糖策略在生物合成丁二酸过程中的应用

该研究通过确定大肠杆菌在产酸阶段葡萄糖的消耗与酸中和剂碳酸钠间的定量关系,建立了pH值反馈控制的补糖策略,能够维持发酵液中葡萄糖浓度在稳定水平。与分批发酵相比,采用pH值反馈补糖且维持葡萄糖浓度在较低的水平对丁二酸的积累是有利的。当采用pH值反馈补糖并控制葡萄糖浓度在10g/L时,丁二酸最终浓度达到57.6g/L,生产效率达到1.15g(/L.h)。

pH值对抗坏血酸-铜离子杀灭水中大肠杆菌的影响

实验室试验表明,抗坏血酸与铜离子在水中对大肠杆菌有协同杀灭作用。此作用在酸性条件(pH 6)下较弱,在碱性条件(pH 8)下较强。

大肠杆菌肌苷酸节点代谢优化高效合成肌苷

该研究以产肌苷的大肠杆菌INO4-5为出发菌,针对其发酵过程中副产物含量高、肌苷产量低以及需要额外添加腺嘌呤等问题,对肌苷酸节点代谢流进行了优化。首先使用不同启动子和核糖体结合位点对枯草芽孢杆菌来源的purA_(bsu)基因进行了表达,以强化腺苷合成支路,使菌株5 L发酵罐上的肌苷产量达到了29.5 g/L,且无需额外添加腺嘌呤。接着通过替换guaB基因的原有启动子以弱化鸟苷合成支路,并过表达guaC基因促使鸟苷酸回流至肌苷酸,使菌株副产物含量显著降低且肌苷产量提升至35.1 g/L;最后对不同5′-核苷酸酶进行了筛选和强化,发现引入来自酿酒酵母的特异性5′-核苷酸酶基因(introduction of specific 5′-nucleotidase gene,ISN1)可有效促进肌苷生产。最终所得菌株INO7-6在5 L发酵罐上发酵,肌苷产量为41.2 g/L,转化率为0.17 g/g葡萄糖,生产强度为0.86 g/(L·h),为目前报道的基因工程菌株的最高产量。

L-酪氨酸连续发酵工艺研究

当前工业上用微生物发酵法生产L-酪氨酸的工艺中,基本都是前期向发酵罐内加入基础培养基,中后期再流加各类营养物质,虽然整个发酵过程中减少了取料和放料的操作,保证发酵中物料不被浪费,但是,随着流加物质的不断增加,发酵液体系不断扩大,该过程在发酵后期需要不断地人为调控发酵参数,而人为调控中,难以避免调控参数波动,并最终影响发酵结果。因此,实验采用高效连续发酵,该工艺可以大大提高菌体活力,并且有效延长产酸高峰期,为了优化L-酪氨酸的高密度连续发酵生产工艺,通过对大肠杆菌TYR-05发酵培养,考察了L-酪氨酸发酵过程并且分析了菌体量、产酸量、产酸效率、糖酸转化率的情况,确定L-酪氨酸高密度连续发酵过程中接种量、糖速率、糖耗量、底糖浓度等关键条件,以达到高密度连续发酵工艺控制条件优化。实验结果表明在5 L发酵罐中,选择30%的种子接种量,发酵起始时,底物氯化胆碱浓度为1 g/L并每4 h向罐内流加0.2 g/L的氯化胆碱,发酵至12 h时,底糖耗尽,开始以12 g/(L·h)的补糖速率向罐内提供葡萄糖,并在此时开始放液,放液速率为0.13 L/h,使得装液量恒定在20%左右,发酵25 h时开始流加复合营养液,发酵35 h时最高菌体OD_(600)达到65,产酸量为55.8 g/L,糖酸转化率为25.4%,为L-酪氨酸连续发酵工业化生产提供了重要参考。

丙二酸的生物合成及其发酵优化

丙二酸作为一种重要的二元羧酸,广泛应用于多种领域。但目前由于生物法合成丙二酸产量较低,不适合进行工业化生产。为提高丙二酸的生物法合成能力,该文以大肠杆菌BL21(DE3)为底盘细胞,通过过量表达ppc、aspA、panD、sdhC、pa0132及yneI基因,构建了丙二酸生物合成工程菌BL21(PPP)。在摇瓶条件下,对该菌株的发酵条件进行了优化,丙二酸合成量达0.48 g/L,较优化前提高了1倍。同时,该文探究了外源添加生物素及富马酸对丙二酸合成的影响,在添加75μg/L生物素的发酵条件下,丙二酸的产量较对照组提高了32.59%;在添加终质量浓度为8 g/L的富马酸的条件下,该菌株可合成1.2 g/L丙二酸。在5 L发酵罐中,该菌株最高可以合成12.42 g/L的丙二酸。该文实现了丙二酸在大肠杆菌BL21(DE3)中的生物合成,并通过对发酵条件的优化进一步提高了丙二酸的产量,为更进一步提高丙二酸产量奠定了基础。

重组大肠杆菌产耐热α-L-鼠李糖苷酶高密度发酵条件的优化

为了减少乙酸的生成,提高重组大肠杆菌生产耐热α-L-鼠李糖苷酶的产量,考查了指数流加培养、两阶段指数流加培养、诱导温度、诱导pH对重组大肠杆菌发酵生产耐热α-L-鼠李糖苷酶(TstRhaA)过程中乙酸含量和酶产量的影响。确定最佳发酵工艺:诱导前比生长速率0.2 h^(-1),诱导后比生长速率0.18 h^(-1),诱导温度33℃,pH 7.2。在最佳发酵工艺条件下,乙酸浓度始终保持在0.8 g/L以下,菌体干重(DCW)最大为69.6 g/L,最高酶活力为589.0 U/mL,是摇瓶发酵的23.4倍,实现了重组大肠杆菌高密度发酵生产TstRhaA。研究结果表明,调节大肠杆菌高密度发酵过程中乙酸含量在合适范围内,能够实现TstRhaA的高效生产,这对其他酶的高密度表达具有重要指导意义。

重组大肠杆菌E. coli BL21/pET28a(+)-mle产苹果酸乳酸酶发酵条件的优化

该研究以实验室构建的重组大肠杆菌E.coli BL21/p ET28a(+)-mle为研究对象,以L-乳酸量为评价指标,通过单因素和正交试验研究了诱导温度、培养基起始pH值、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度和诱导时间对重组大肠杆菌E.coli BL21/p ET28a(+)-mle分泌表达苹果酸乳酸酶(MLE)的影响。结果表明,重组大肠杆菌E.coli BL21/p ET28a(+)-mle分泌表达苹乳酶的最佳培养条件为培养基起始pH值为5.9,诱导温度为28℃,IPTG浓度0.6 mmol/L,诱导时间3 h。在此优化条件下,L-乳酸产量为2.37 g/L,较优化前提高9.48倍。

B族维生素对大肠杆菌发酵生产乳清酸的影响

为提高大肠杆菌发酵乳清酸的产率和糖酸转化率,以大肠杆菌(Escherichia coli)Ora-6为供试菌株,在原有培养基的基础上,通过单因素试验及正交试验探究维生素B_(1)、维生素B_(3)、维生素B_(5)、维生素B_(6)、维生素B_(7)、维生素B_(12)几种关键B族维生素对菌体生长及产酸能力的影响,并确定最佳组合添加量为维生素B_(1)6.8 mg/L,维生素B_(3)4.8 mg/L,维生素B_(5)4 mg/L,维生素B_(6)3.4 mg/L,维生素B_(7)1.4 mg/L,维生素B_(12)4 mg/L。在此条件下,经5 L发酵罐验证对比,此时优化后的培养基菌体量(OD 600)、乳清酸产量、糖酸转化率分别为134.32、121.41 g/L和25.73%,较原始培养基分别增长了13.16%、15.47%、12.96%。同时研究确定了B族维生素采取从10 h持续流加的发酵优化策略,使得5 L发酵罐发酵乳清酸最终菌体量和产量分别达到148.23、138.2 g/L,为工业化发酵生产乳清酸提供了参考依据。

葡萄糖添加量对色拉米生产过程中主要栅栏因子的影响

为了提高发酵香肠生产的安全性,本实验针对不同的葡萄糖添加量对色拉米生产过程中pH值和水分活度两个重要栅栏因子以及乳酸菌数和大肠杆菌数的影响进行了研究。结果表明,随着葡萄糖添加量的增多,色拉米pH值下降越快,终点pH值越低;水分活度也随着葡萄糖添加量的增多下降越快;发酵期葡萄糖添加量越多,乳酸菌生长速度越快,进入干燥期后,葡萄糖添加量对色拉米中乳酸菌数的变化没有显著影响;葡萄糖添加量越高,未检出大肠杆菌时间越早。因此,在可接受的酸度和口感范围内,适当增加葡萄糖的添加量,可有效提高色拉米的食用安全性。

利用木薯淀粉为原料发酵生产丁二酸的研究

利用木薯粉为原料发酵生产丁二酸,将先糖化后发酵(SHF)和同步糖化发酵(SSF)2种发酵模式进行比较,发现SSF发酵模式在工艺上、产量上均优于SHF,进而对SSF的一些工艺条件进行摇瓶优化,得到SSF的最适发酵温度为37℃,糖化酶添加量为1000U/g,最适底物浓度60g/L。在7L发酵罐中进行放大实验,用木薯粉同步糖化发酵45h,最终丁二酸浓度为61.2g/L,乙酸浓度为4.66g/L,生产强度达到1.36g/(L.h),丁二酸转化率为89%。

不同还原性碳源对重组大肠杆菌厌氧发酵生产丁二酸的影响

以过量表达苹果酸酶的大肠杆菌NZN111为出发菌株,考察菌体对不同碳源的利用情况,并用3L发酵罐以不同还原性碳源作为底物测定发酵过程中菌体生长、代谢物浓度以及NADH量和氧化还原电位值(ORP)的变化。结果表明,以甘露醇、葡萄糖和葡萄糖酸钠作为碳源时,丁二酸收率分别为99.7%,83.0%和40.5%,还原性越强的碳源发酵过程产生的NADH量越多,且NADH量随着发酵时间逐渐降低,发酵结束时ORP分别为-358mV,-367mV和-384mV。由此可知,还原性越强的碳源产生的NADH量越多,发酵结束时丁二酸产量越高,副产物乙酸产量越低,氧化还原电位值越高。

琥珀酸发酵菌种研究进展

琥珀酸作为一种重要的化学中间体的潜力已经为人们所认识,而发酵法生产琥珀酸是使这一潜力变为经济上可行的最好方法之一。菌种在发酵法中占有非常重要的地位,是决定整个过程的关键。系统介绍了关于发酵法生产琥珀酸的菌种研究进展,并对各种菌株的发酵特点和问题做了分析,最后展望了菌种的发展方向。

大肠杆菌产生的聚唾液酸的结构

研究了大肠杆菌产生的聚唾液酸的分子结构,对聚唾液酸的分子基团特征进行了红外光谱分析,研究了聚唾液酸糖苷键的连接方式和构型.发酵液中的聚唾液酸经超滤浓缩、有机沉淀和离子交换层析处理,得到高纯度的聚唾液酸.经13C-NMR分析和比较,表明所得到的聚唾液酸是一种-α2,8糖苷键连接的同聚物.

大肠杆菌工程菌利用玉米浆发酵产L-乳酸的研究

在以玉米浆为有机氮源,葡萄糖结晶废糖液为碳源的发酵培养基上对大肠杆菌工程菌HBUT-L进行了4L发酵产L-乳酸研究,确定了HBUT-L在玉米浆发酵培养基中能生长,并且可高效快速地将葡萄糖发酵转化成L-乳酸。乳酸产量达到108.3g/L,50h内发酵结束,L-乳酸光学纯度在99%以上,糖酸转化率在97%以上,产率为2.16g(/L.h),是无机盐发酵培养基产率的79.7%。为HBUT-L利用玉米浆发酵产L-乳酸,降低生产成本及其工业化提供参考。