一株鸡源致病性大肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性

目前,在鸡业发展过程中,大肠杆菌病是一种较为常见高发病,常造成鸡局部或全身性感染[1-2].大肠杆菌病是一种条件致病菌,差的卫生条件、不良的卫生管理,很容易造成大肠杆菌病的发生.随着养鸡业规模化、集约化的不断发展,大肠杆菌病越发严重,病原对抗生素和抗菌药的耐药性越来越强.为了防治鸡大肠杆菌病,饲养主大多采用饲喂抗生素或抗菌药物的方法,但普遍存在耐药性和用药成本升高等问题.同时,由于长期使用抗生素或抗菌药,使产品存在药物残留,导致产品品质下降,很难满足人们对绿色健康养殖的要求.

黄芩、黄连等对猪致病性大肠杆菌的体外抑菌试验

无菌采集发病仔猪的粪便和肠内容物,经细菌分离纯化培养、形态学观察、动物致病性试验,结果表明分离所得大肠杆菌为强致病性大肠杆菌。将黄芩、黄连、石榴皮、甘草、大黄、鱼腥草、苦参、地榆8种单味中药经水煮处理制成浓度为1g/mL的受试溶液,对所得的大肠杆菌进行体外抑菌试验。试验结果表明,不同的中草药对分离所得到的大肠杆菌具有不同的抑制作用。

蒲公英不同提取物对大肠杆菌体外抑菌活性的作用

【目的】考察蒲公英对大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)的体外抑制作用及其对E.coli蛋白质表达的影响。【方法】蒲公英药材粉末用水煎煮以及用不同极性溶剂(正己烷、乙酸乙酯、蒸馏水)依次进行提取,制成8种供试液。采用微量稀释法测定8种供试液对E.coli DH5α的抑菌活性,绘制E.coli在水煎液作用下的生长曲线;采用薄层色谱法(TLC)分析8种供试液的化学组成,通过十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和双向电泳(2-DE)法分析蒲公英对E.coli蛋白质表达的影响。【结果】蒲公英水煎液对E.coli有较强的抑菌活性,其最小抑菌浓度(MIC)为1.95 mg/m L;蒲公英乙酸乙酯相3对E.coli的MIC为0.13 mg/m L,相当于含19.23 mg/m L生药;正己烷、乙酸乙酯提取部位对E.coli没有明显的抑菌活性。TLC分析显示:正己烷和乙酸乙酯1不含绿原酸;乙酸乙酯相2、3部位斑点多且均明显。与空白组比较,蒲公英作用后E.coli生长受到抑制。SDS-PAGE和2-DE分析结果表明:蒲公英会影响E.coli的蛋白表达,其中2-DE分析结果显示乙酸乙酯相3的2×MIC作用大肠杆菌21 h后检测到的蛋白质点比空白对照图谱少92个,其中大肠杆菌可溶性蛋白表达量下调2倍的蛋白点有24个,上调2倍蛋白质点有19个,蒲公英乙酸乙酯相3作用于大肠杆菌后,大肠杆菌可溶性蛋白(p H3-10)表达量明显下调,蒲公英对大肠杆菌蛋白质表达具有抑制作用。【结论】蒲公英对E.coli的抑菌作用显著,绿原酸等水溶性成分的抑菌活性成分主要集中在水溶性部位,可通过影响细菌蛋白质的表达达到抑菌效果。

猪源大肠杆菌脂多糖的提取、纯化及活性分析

为了从猪源大肠杆菌中获得纯度高、产率高的脂多糖(lipopolysaccharides,LPS),并评价其毒力,本试验采集仔猪腹泻粪便作为病料,进行细菌分离鉴定和16SrDNA鉴定,采用热酚水法提取细菌的LPS,通过DNaseⅠ、RNaseA、蛋白酶K和醇沉法对LPS进行纯化,通过苯酚硫酸法、Bradford法和紫外分光光度法测定LPS多糖、蛋白及核酸含量,鲎试剂定量法测定其活性,采用小鼠急性毒性试验方法测定小鼠半数致死量(LD50)。结果显示,分离获得一株具有高致病性的猪源大肠杆菌,纯化的猪源大肠杆菌LPS平均产率为3.74%,其中多糖含量为13.40%,蛋白含量为0.48%,核酸含量为0.06%,主要条带集中在14~160ku范围内,鲎试剂定量法测定其活性为1.21×107 EU/mg,提取LPS对小鼠的LD50为31.86mg/kg。该猪场仔猪腹泻是由致病性大肠杆菌引起,获得其毒力因子LPS纯度高、产率高、毒力强,这将为临床防制猪大肠杆菌病及LPS提取纯化提供理论依据。

纳米金比色芯片检测和鉴定病原微生物

目的 :建立一种简单、快速的比色芯片判断PCR产物存在与否的方法。方法 :在多重PCR过程中掺入生物素化的dUTP (biotin 16 dUTP )制备生物素化的靶序列 ,与相应的生物芯片杂交后 ,用链霉亲和素 纳米金结合银染的方法鉴定 4种不同大肠杆菌血清型。同时 ,为了与链霉亲和素 藻红蛋白染色方法进行比较 ,用这两种方法检测了大肠杆菌血清型O15 7:H7的rfbE扩增产物。结果 :纳米金比色芯片检测结果与琼脂糖凝胶电泳的结果一致 ,芯片杂交的纳米金标记与荧光标记检测的结果相当。结论 :纳米金比色芯片能够对 4种不同的大肠杆菌血清型进行准确鉴定 ,而且不需复杂的仪器 。

特异性抗肝癌单链抗体的优化表达与纯化及其生物学活性鉴定

目的:制备有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体。方法:以ITPG诱导大肠埃希菌HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体;利用HiTrap抗ETag亲和层析柱对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化;纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以Bradford检测法测定其浓度,ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性。结果:在培养基中加入0.4mol/L蔗糖,以IPTG1mmol/L于30℃诱导12h,抗肝癌scFv可溶性表达量较多,纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325mg/L,相对分子质量为29×103。与肝癌细胞结合效价为1:64,与肝癌组织结合阳性率为75%,具有良好的生物学活性。结论:成功获得具有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体,为肝癌靶向诊断及治疗的开发与应用奠定了基础。

乳源抗菌-免疫调节融合蛋白原核表达和纯化

目的构建乳铁蛋白抗菌肽(LfcinB)与免疫调节肽(PGPIPN)融合肽表达质粒,并在大肠杆菌BL21中表达及纯化。方法采用重叠延伸PCR技术获得融合肽基因片段,并构建到原核表达载体pGEX-KG中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。用Glutathione Sepharose4B亲和层析方法纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pGEX-KG-FP,并在大肠杆菌BL21中诱导其高表达。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗GST单克隆抗体所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。经Glutathione Sepharose4B纯化后,得到较纯的GST-FP融合蛋白。结论构建了原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该融合蛋白。

重组葡激酶及其在大肠杆菌中高效表达与纯化

目的 研究高效表达葡激酶载体的构建及其体外表达与产物的纯化。方法 用PCR方法扩增葡激酶cDNA ,插入质粒pET 2 2b中构建成表达载体 ,转化入大肠杆菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达 ,表达产物用Q Poros和S Sepharose纯化。 结果 经限制性内切酶酶切图谱分析和DNA序列测定证明所构建质粒为葡激酶重组质粒 ,体外表达产物经离子交换纯化后HPLC纯度达 98%以上 ,SDS PAGE和WesternBlot实验证实该产物为葡激酶。结论 成功构建了重组葡激酶表达载体 ,并经表达纯化获得高纯度葡激酶 ,为产业化和临床应用奠定了良好基础。

人NKp44基因克隆及其在大肠埃希菌中的表达和纯化

目的:对人NKp44进行基因克隆及其在大肠埃希菌中重组表达,为进一步研究NK细胞抗肿瘤作用奠定基础。方法:提取人外周静脉血单个核细胞,培养并加入IL-2进行诱导后收集细胞,分离纯化外周血总RNA。用巢式PCR扩增hNKp44片段(约860bp),克隆至质粒载体pMD18-T,并对克隆的DNA片段进行序列分析。用限制酶EcoRⅠ和NcoⅠ消化pMD18-T-hNKp44重组质粒,分离hNKp44片段,并插入原核表达载体pET30a(+)的相应限制酶位点,酶谱分析鉴定重组表达载体pET30a(+)-hNKp44。转化菌株BL21(DE3)经IPTG诱导,用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定表达的重组蛋白。采用His.BindPurificationKit对重组蛋白进行纯化。结果:巢式PCR扩增的DNA片段与hNKp44cDNA大小一致。重组质粒pMD18-T-hNKp44的DNA序列分析显示,克隆的DNA序列与文献报道的hNKp44的cDNA序列一致。SDS-PAGE表明,重组蛋白相对分子质量为35.4×103,其表达量达菌体总蛋白的40%左右。WesternBlot分析显示,重组蛋白能特异地与抗His.Tag抗体结合。纯化得到纯度为95%的重组蛋白,纯化回收率达40%。结论:已经成功地构建了表达重组hNKp44的工程菌株。

分离病鸡3株大肠埃希菌的鉴定及毒力和细胞毒测定

目的 分离病鸡中 3株大肠埃希菌和鉴定其对小鼠的致病力及对Vero细胞毒性作用。方法 将按常规细菌的分离并鉴定的 3株大肠埃希菌 ,接种至昆明系小鼠体内做毒力试验 ,计算死亡率和LD50 (5 0 %致死量 )。采用微量单层细胞培养法测定细菌上清液的细胞毒性作用。结果 分离的 3株细菌生物学性状均符合大肠埃希菌。分离的 3株细菌对小鼠致病率为 10 0 % ;菌量达 6× 10 11CFU/L时死亡率为 10 0 % ;LD50 为 1 5× 10 10 CFU/L。分离的 3株细菌对 2株细胞均无细胞毒性作用。结论 分离的 3株致病性大肠埃希菌与O157∶H7株对小鼠致病力相似 ,可能是潜在的人类的传染源。

梅花鹿鹿角盘蛋白的分离纯化及其对大肠杆菌抑菌机制的初步研究

目的分离纯化梅花鹿鹿角盘蛋白并对其抑菌机制进行初步探究。方法以鹿角盘为原料,采用酸提醇沉提取鹿角盘总蛋白,SephacrylS-100HR和反向高效液相层析分离纯化鹿角盘抗菌蛋白,最终确定蛋白质分子质量。以大肠杆菌为研究对象,测定抗菌蛋白的最小抑菌浓度(MIC);结合荧光显微镜、扫描电镜、流式细胞仪等方法从大肠杆菌细胞膜通透性、完整性和ROS活性氧的产生等方面探讨鹿角盘蛋白对大肠杆菌的抑制机制。结果 SephadexG-25除盐后总蛋白含量为90.3%,经SephacrylS-100HR凝胶层析获得分子量<20.1 kDa的蛋白组分S2对大肠杆菌具有抑菌活性,将S2(<20.1 kDa)组分通过反相高效液相得到抗菌蛋白18.963 kDa。抗菌蛋白在浓度为5 mg/mL时对大肠杆菌具有最小抑菌能力;处理组在一定时间内电导率、β-半乳糖苷酶活性的显著差异表明细胞膜通透性受损;扫描电镜发现抗菌蛋白作用后菌体出现变形、塌陷、皱缩、破碎,荧光显微镜观察PI单染处理组荧光强度增强,说明抗菌蛋白破坏了大肠杆菌细胞膜、细胞壁的完整性;菌体经抗菌蛋白浓度为2倍最小抑菌浓度(2 MIC)处理2 h,流式细胞仪检测ROS表达量为69.3%,菌体氧化应激水平显著提高,从而对大肠杆菌起到一定的抑制作用。结论鹿角盘蛋白经过分离纯化后得到的抗菌蛋白可能通过改变大肠杆菌细胞膜通透性、细胞壁完整性和提高菌体氧化应激水平,从而起到抑菌的作用。

泌尿外科病房大肠埃希菌流行病学调查

目的 探讨泌尿外科病区大肠埃希菌的流行病学分布及其耐药性。方法 采用病房现场采样 ,了解大肠埃希菌的分布。结果 采集的 176 5份样本共检出大肠埃希菌 86株 ,平均检出率为 4 .9%。其中 ,产 ESBL s菌为 35株。大肠埃希菌耐药率低的抗生素是亚胺培南、阿米卡星、哌拉西林 /三唑巴坦 ,<15 % ,产 ESBL s菌对二、三代头孢菌素的耐药性较高 ,>5 0 %。结论 大肠埃希菌是泌尿外科病区的常见病原菌 ,治疗其感染时 ,应根据药敏结果及患者病情选用氨基糖苷类、β-内酰胺类抗生素

芜湖地区动物宿主携带O157:H7大肠杆菌的调查

目的 了解 O15 7:H7大肠杆菌在芜湖地区动物宿主中的存在现状及其生物学特性。方法 2 0 0 0年 6～ 10月选择芜湖县境内畜禽粪便标本及养殖场饲料和水样标本 894份 ,以免疫磁珠法和血清学方法检测 O15 7:H7大肠杆菌。结果 894份标本中检出 3株 O15 7:H 7大肠杆菌 ,检出率为 0 .34 %。检出菌株产毒情况 :羊标本检出菌株产志贺毒素和溶血素 ,奶牛标本检出菌株产溶血素 ,猪标本检出菌株不产毒。结论 芜湖地区存在 O15 7:H7大肠杆菌 ,应引起足够的重视。

重组人类肥胖抑素在大肠杆菌中的大规模纯化

目的 探讨产率较高 ,高度纯化大肠杆菌表达重组肥胖抑素的方法 ,深入研究肥胖抑素的分子结构 ,生物活性及临床应用 ,对在大肠杆菌中表达的重组人类肥胖抑素进行纯化。方法 温度诱导表达携有人类肥胖基因 (ob)片段的大肠杆菌重组子 ,采用酸沉淀结合凝胶过滤层析的方法从包涵体中纯化目的蛋白。结果 1周内从 3L培养液 (10g)湿菌体中可获得 70mg高度纯化的重组人类肥胖抑素。结论 在短期内成功获得了高产高纯化的重组人类肥胖抑素 ,为肥胖抑素的产业化及临床应用奠定了基础。

徐州市大肠杆菌O157∶H7感染性腹泻爆发因素分析

目的研究O157∶H7感染性腹泻疫情爆发与腹泻病人、宿主动物、苍蝇、食品携带(污染)O157∶H7状况的相关程度。方法调查1999—2011年O157∶H7感染性腹泻疫情资料,采集疫情爆发点和监测点腹泻病人、宿主动物粪便标本和苍蝇、食品标本分离菌株。采用趋势χ2检验和Spearman’s等级相关进行统计分析。结果腹泻病人、宿主动物粪便标本、苍蝇、食品带菌连续性监测结果证实了其与O157∶H7感染性腹泻爆发的关系。结论江苏省徐州市O157∶H7感染性腹泻爆发与腹泻病人带菌率、苍蝇带菌率、食品带菌率关联强度大。苍蝇与污染的食品对疾病的传播作用明显。