重组拖丝蛋白基因在大肠杆菌中表达条件的优化

对已构建的重组蜘蛛拖丝蛋白基因表达菌株 p NS2 ,以 IPTG为诱导剂 ,建立最适表达条件 .在 LB培养基中添加质量分数为 0 .1 %的甘氨酸和丙氨酸 ,菌体培养至密度 A6 0 0 =0 .5～ 0 .7时加入浓度为 0 .2 mmol/ L的 IPTG,诱导 5 h,可得到表达量占可溶性总蛋白质 2 7.2 %的较好结果 .

耐高温葡萄糖异构酶的全细胞固定化条件研究

对三羟甲基磷交联Thermus oshimai葡萄糖异构酶重组菌的固定化工艺进行研究。确定所用硅藻土载体粒径36.8μm、聚凝剂聚乙烯亚胺分子质量为70 000 Da、交联剂合成前体为四羟甲基硫酸磷;运用最优的固定化条件:0.3 g硅藻土、5 mmol/L Mn^(2+)、0.12%(体积分数)聚乙烯亚胺絮凝1 h、1.5%(体积分数)三羟甲基硫酸磷交联1.5 h,所制备的固定化细胞酶活可达138.4 U/g。应用该催化剂于85℃和1 100 mmol/L D-葡萄糖底物条件下连续催化10批次,催化剂仍保留91%以上酶活,D-果糖转化率始终维持在51.7%以上。该工艺可以连续生产高果糖浓度高果糖浆,有效简化后续分离提取工艺,为进一步使用符合食品工业要求的表达系统连续制备高果糖浆奠定基础。

一新中温碱性蛋白酶基因的克隆及原核表达（英文）

【目的】从环境中分离筛选产蛋白酶、降解蛋白质的菌株,寻找使用价值较高的碱性蛋白酶。【方法】通过酪蛋白平板法分离筛选产蛋白酶菌株,经生理生化方法及16S rDNA基因序列鉴定菌株;利用简并引物及基因组步移克隆蛋白酶完整开放阅读框;蛋白酶前体蛋白及成熟肽序列在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中进行重组表达;纯化活性蛋白酶后,利用化学合成多肽底物(succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide)检测酶活性质及其催化活力。【结果】分离到的菌株L010被鉴定命名为芽胞杆菌(Bacillus sp.)L010;蛋白酶开放阅读框包含了1149个碱基,编码382个氨基酸,氨基酸序列按其功能分为N端的30个氨基酸残基组成的信号肽,77个氨基酸残基构成的前导肽,C端275个氨基酸残基组成的成熟肽;此蛋白属于丝氨酸蛋白酶家族中枯草杆菌蛋白酶类(Subtilisins)成员,并命名为SprD;SprD的前体蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中重组表达时,在前导肽辅助下自加工为活性蛋白酶;SprD呈现出较高的催化活力,其反应最适条件为温度70℃,pH 9-10。【结论】SprD在碱性(pH 7.0-10.0)、中高温(25℃-60℃)条件下的稳定性及较高的催化能力使其具有一定的研究和潜在利用价值。

特异腐质霉角质酶-OMP25融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

【目的】通过探究特异腐质霉角质酶-OMP25融合蛋白(HiC-OMP25)在不同大肠杆菌(Escherichia coli)菌株中的表达情况、底物降解情况、热稳定性及宿主菌细胞膜通透性与细胞表面疏水性,揭示表达HiC-OMP25时不同宿主菌的差异性,并进一步提高HiC-OMP25在大肠杆菌中的表达量。【方法】分别在E.coli BL21(DE3)及E.coli C43(DE3)中表达HiC-OMP25,并测定其对对硝基苯丁酸酯(4-nitrophenol butyrate,p NPB)、聚丙烯酸乙酯(polyethyl acrylate,PEA)的降解效果、50℃稳定性;测定表达HiC-OMP25时宿主菌的细胞膜通透性及细胞表面疏水性变化;共表达伴侣蛋白提高HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中的表达量。【结果】HiC-OMP25在E.coli BL21(DE3)与E.coli C43(DE3)中均成功表达并降解pNPB,但前者对PEA的降解效果及50℃稳定性均低于后者。同时,表达HiC-OMP25显著增强了E.coli BL21(DE3)的细胞膜通透性及细胞表面疏水性。HiC-OMP25与巯基氧化酶(Erv1p)、二硫键异构酶(DsbC)在E.coli C43(DE3)中共表达时,其表达量为原始菌株的2.14倍,且对pNPB及PEA均有良好的降解效果。【结论】异源表达时,HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中正确折叠,而在E.coli BL21(DE3)中未完全正确折叠;通过共表达伴侣蛋白提高了HiC-OMP25在E.coli C43(DE3)中的表达量,为以后HiC-OMP25的工业化生产及应用奠定了基础。