The stress response factor RpoS is required for the natural transformation of Escherichia coli

The natural transformation of Escherichia coli is a novel and recently developed system that has significance for genetic studies and the biological safety of genetic engineering.However,the mechanisms of transformation,including development of competence and DNA uptake,are not thoroughly understood.In this study,we demonstrated the effect of the general stress response regulator RpoS,which has been associated with E.coli transformation,on natural transformation performed in an‘‘open system’’.We find that RpoS is required for natural transformation but not to artificial transformation and RpoS mainly affect transformation in the liquid culture prior to plating.In the liquid culture,RpoS over-expression promotes natural transformation in early exponential phase and static incubation accumulates RpoS and promotes transformation to a limited extent.These findings provide detailed understanding of RpoS function on natural transformation.

电转化法制备高转化效率的E．coli感受态细胞研究

为了制备高转化效率的E．coliTG1和E．coliDH5a感受态细胞，采用电转化方法探索E．coli生长对数期的不同生长阶段、质粒DNA含量、电场强度对E．coli转化效率的影响。研究结果表明：40μL菌液中加1．0ngpUC19DNA，用间隙0．2cm电击杯时转化效率最高，E．coli TG1有1个电转化效率峰值，即A600为0．665时，转化效率达1．7×10^9cfu／μg pUC19DNA；E．coliDH5a有2个转化效率峰值，即A600为0．443和0．810时，转化效率均为3．0×10^9 cfu／μg pUCl9DNA。研究结果表明，在相同情况下E．coliDH5a的转化效率高于E．coli TG1，利用本实验确定的参数可制备出高转化效率的电转化感受态细胞。

一种快速脱盐制备大肠杆菌电转化感受态细胞的方法

为了建立一种高效快捷的大肠杆菌(Escherichia coli)电转化方案,采用类似密度梯度离心的方法,使用角转子离心机达到快速除盐的目的。研究发现,以20%甘油(V/V)/1.5%甘露醇(m/V)溶液作为梯度介质,采用菌悬液与梯度介质比例为1∶5(V/V)时形成的密度梯度可有效地进行离心除盐,离心后的细胞以20%甘油(V/V)/1.5%甘露醇(m/V)溶液重悬,随后在电场强度为15 kV/cm的条件下进行电转化能得到较高的转化效率,而在室温条件下进行电转化试验不能提高转化效率。本研究仅通过2次离心,电转化效率可达到4.2×109 CFU/μg DNA,大大简化了试验流程。

大肠杆菌HB101感受态的热化学研究

利用LKB-2277生物活性检测系统,测定了在生理盐水中,采用氯化钙法建立大肠杆菌感受态过程中的代谢热输出.生理盐水中大肠杆菌及其感受态进行内源代谢的热化学方程满足:P=Kc+Adc/dP_0=K’c^0氯化钙处理后,K与P_0均增大,说明内源代谢活性增强,这与大肠杆菌感受态建立过程中一系列生理生化活性的调整是一致的,表明大肠杆菌感受态的建立很可能有其内在的调节机制,而不完全是人工诱导的.

三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化

描述了一种改良的高效细菌感受态的制备和感受态细胞的保藏及细菌的转化方法.三种不同的大肠杆菌分别是DH5α,TG1和XL1blue,其中最有效的是XL1blue.每种菌株的感受态细胞制备的最佳光密度(OD600值)不同.对感受态细胞的存储时间及其与转化效率之间的关系也进行了研究,结果显示感受态细胞可以在-20℃存储7d,在-70℃存储15d.将常见的方法做了三种改进:首先是将CaCl2溶液改为TB溶液;其次是将培养基由LB换成S.O.C;再就是在质粒对感受态细胞的转化过程中加入DMSO或PEG8000.改良的细菌转化系统比常见的方法能提高转化效率约1000倍,是一种高效的细菌转化系统.

制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究

旨在建立一种高效大肠杆菌电转化感受态细胞的制备方法,研究了摇瓶装液量,菌体生长阶段,转化电场强度,转化后复苏时间以及感受态细胞存放时间等对转化效率的影响。结果表明,装液量为400 mL/2 L,菌体在OD600值为0.452时收集所制备的感受态细胞,在电场强度12.5 kV/cm条件下电击5 ms,转化后复苏时间2 h,转化效率可达到1010CFU/μg DNA。此条件下制备的感受态细胞转化效率高,质量稳定,重复性好。

感受态细胞制备与保存方法的比较研究

目的 :确立一个能制备高转化率感受态细胞并长期维持其感受性的实验方案。方法 :比较CaCl2 法、TSS法、超高效法制备感受态细胞的效果 ,选用三者中较好的方法进一步探讨不同生长期 (OD值 0 .2～ 1.1)的细菌对制备感受态细胞的影响 ,并分别比较了不同冷冻保护剂 (7%DMSO ,10 %甘油 )于 - 2 0℃、- 80℃冰箱保存感受态细胞的效果。结果 :三种方法获得的感受态细胞转化率差异极显著 (P <0 .0 1)。采用超高效法 ,OD值为 0 .36 (或 0 .5 8)时收集菌体可获得 1.1× 10 8的高转化率的感受态细胞 ,以 7%的DMSO为冷冻保护剂保存感受态细胞可维持 10 7以上的转化率 4

大肠杆菌DH5α菌株感受态制备及转化率变化研究

通过氯化钙法制备大肠杆菌DH5α菌株感受态,讨论了不同保存温度和保存时间对感受态转化率的影响。结果表明,在4℃下保存,8h达到最高转化率;在-20℃和-70℃下保存,均为48h达到最高转化率。通过氯化钙法制备的DH5α菌株感受态细胞,在-20℃条件下简单保存,20d内完全可以满足一般转化研究的要求,不需要复杂的甘油、液氮处理及超低温要求。

大肠杆菌感受态细胞转化能力的影响因素

探讨了大肠杆菌菌株、细菌生长状态、转化溶液、抗冻剂及保存时间、质粒长度和纯度对感受态细胞转化能力的影响。结果表明,以100 mmol/L CaCl2为缓冲液,采用经活化培养的A600为0.55的TG1制备的感受态细胞,在冰上放置6h后转化,所得转化率最高,可达2×106-4×107cfu/μg DNA(pUC19)。随着质粒长度增加和纯度降低,转化率有所下降。若感受态细胞要保存备用,以15％甘油为抗冻剂优于7％DMSO,但添加抗冻剂对转化率有抑制作用。贮于甘油的感受态细胞在-70℃冻存两个月后仍有较理想的转化率。

温度对大肠杆菌感受态细胞的影响

在不同的培养温度下制备一系列大肠杆菌感受态细胞,并选取其中一组感受态细胞在4种不同的温度下保存,对培养温度与大肠杆菌感受态形成的关系以及感受细胞在不同保存温度下的保持情况进行了研究.结果表明,不同培养温度下大肠杆菌生长出现高峰期不同.其中,18℃和25℃,出现于对数期早期,而30℃和37℃则出现于对数期中后期.在25℃条件下转化效率最高.感受态细胞在4种不同温度条件下保存,受活菌数和感受态2种因素的影响程度都不同.转化效率在前期都有不同程度的提高,液氮条件下保存感受态细胞时间最长.

大肠杆菌HB101感受态细胞的显微观察与分析

对数生长前期的大肠杆菌在生理盐水中用CaCl2可以直接诱导建立感受态并完成转化过程.利用H-8100透射电子显微镜观察用CaCl2直接在生理盐水中诱导建立感受态的大肠杆菌细胞,发现感受态细胞整体电子密度趋于均匀,但存在有电子密度较高颗粒,表明大肠杆菌感受态建立过程中,细胞整体对电子通透性增强,可能存在涉及细胞膜通透性的复合物重新形成相关的胞内物质代谢及其在细胞内定位的受控改变,暗示大肠杆菌可能具有建立自然感受态的能力.

大肠杆菌感受态细胞保存条件的研究

研究了保存时间、温度和抗冻剂对大肠杆菌感受态细胞保存的影响。结果表明:在4℃-、40℃、-70℃条件下,大肠杆菌感受态细胞转化效率在保存前期随保存时间增加呈上升趋势,转化效率在第1天或第7天达到最大值,此后随保存时间增加而呈下降趋势;在保存前期,保存于4℃的大肠杆菌感受态细胞转化效率高于保存在-70℃、-40℃的大肠杆菌感受态细胞的转化效率,在保存后期低于保存在-70℃、-40℃的大肠杆菌感受态细胞的转化效率;在相同保存温度和保存时间下,保存在甘油的大肠杆菌感受态细胞转化效率高于保存在DMSO的大肠杆菌感受态细胞的转化效率。

少量制备大肠杆菌感受态细胞条件探索

目的：为了获得重复性好、转化率高的少量制备感受态细胞的方法，利用不同生长时期的大肠杆菌感受态细胞，进行转化比较。方法：根据普通实验室的实验条件，常规方法提取质粒，氯化钙法转化不同生长时期的大肠杆菌感受态细胞，比较转化率。结果：大肠杆菌感受态细胞的转化率与0D值显著相关，在OD600nm为0.39和0.55时转化率最高，在OD600nm为0.28．0.55之间均可得到理想的转化效果。结论：少量制备感受态细胞方法操作中无需添加任何保护试剂和细胞复苏培养，操作简便、重复性好，实验成本低廉。

大肠杆菌最佳感受态细胞制备的探讨

本文对４种大肠杆菌菌株在不同生长时期的转化效率分别进行了测定．结果表明，在细菌的生长繁殖过程中，其转化效率是有很大变化的．对于不同的菌株，它们获得高转化率时的活菌数不同．同时，得到了这４种大肠杆菌菌株制备最佳感受态细胞的条件．

Ce^(3+)对大肠杆菌感受态建立和转化的影响

利用Mg2+、Ce3+取代Ca2+诱导大肠杆菌感受态的建立,发现Mg2+、Ce3+不能独立诱导大肠杆菌建立感受态,只有在存在Ca2+的情况下才能诱导大肠杆菌建立感受态,Mg2+和Ce3+在低浓度时可以提高转化效率,但在高浓度时对转化有抑制作用,结果表明Ce3+与Ca2+一样,可能对大肠杆菌转化具有生理性调节作用。

大肠杆菌JM109感受态形成因素分析

目的：分析大肠杆菌JM109感受态形成因素,提高转化效率。方法：采用不同生长状态、不同转化溶液、不同保存时间及热激处理时间的细菌制备感受态,分析转化效率。结果：以20mmol/L MgCl2＋80mmol/L CaCl2为处理液,经活化培养OD600为0.82的菌液制备感受态细胞,4℃放置12-24h之内,42℃热激处理60s,转化效率最高,可达9.8×10^6-1.2×10^7cfu/μg DNA（pUC19）。随着质粒长度增加,转化效率下降。结论：感受态细胞形成与生长状态关系密切,金属离子、有机溶剂对感受态的形成影响显著。感受态形成过程中,细胞可能发生了一系列的生理变化。

一种简捷有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法

[目的]探索建立简捷快速有效的大肠杆菌感受态细胞制备方法。[方法]在已有的TSS法基础上进行了进一步的改进，建立了一个只需一步室温离心便能够获得与常规方法效价相近，能够长期保存的大肠杆菌感受态细胞的制备方法。[结果]新方法制备的感受态细胞每微克转化菌落数达105-106个，可以满足在质粒中进行的常规克隆需要。不同冻存时间对新方法制备的感受态细胞转化效率无显著影响。新方法制备的感受态细胞可以立即使用也可以于-80℃下长期保存至少9个月不会影响其转化效价。这也与常规CaC l2法制备的感受态细胞性能相当。[结论]该方法为一次大量制备并长期保存使用感受态细胞奠定了基础。

影响大肠埃希菌感受态细胞因素的探讨

研究不同型号的菌株、不同转化溶液、感受态细胞的存放时间、转化时间及转化后的复苏时间等对质粒转化效率的影响。结果表明,转化溶液浓度和感受态细胞的存放时间对转化效率有明显的影响,而转化时间、冰浴时间和转化后的振荡培养复苏时间对转化效率的影响不明显。

大肠杆菌HB101感受态细胞制备条件的优化

为探讨大肠杆菌HB101感受态细胞制备的最优条件,从菌种来源、感受态细胞的生长状态及其储存方式等3个方面进行了优化。结果表明:从-70℃冰箱中保存的菌种活化大肠杆菌HB101,当细胞的OD600值为0.3～0.4时制备感受态,4℃冰箱放置1d,-70℃下放置1个月,均可获得较高的转化效率,每微克DNA最高可达1.18×107cfu。

快速准确制备大肠杆菌高效感受态细胞中有关OD_(600)值的探讨

目的探讨在不同转速下大肠杆菌OD600值与时间的关系，为能快速而准确的制备高效感受态细胞提供OD600值的量化标准。方法在不同转速下每隔一定时间测定大肠杆菌OD600值。结果总结了不同转速下OD600值在0．3—0．4所需时间段，并且用此时间段培养的细菌制备的感受态细胞的转化效率可高达（6．45±0．05）×107转化子／μg DNA。结论用此法制备的感受态细胞完全可以满足大部分在质粒中进行的常规克隆的需要。