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多重PCR方法检测大肠杆菌O157∶H7的初步研究 被引量:13
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作者 朱文冠 薛素强 +2 位作者 洪洁心 崔剑峰 郭霄峰 《中国人兽共患病学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第5期428-432,共5页
目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157∶H7的O157抗原基因(rfbE基因)、鞭毛H7抗原基因(fliC基因)、粘附素基因(eaeA基因)和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ(SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因)为扩增对象,设计能导至目的... 目的研究一种快速、特异的检测大肠杆菌O157∶H7的多重PCR方法。方法以大肠杆菌O157∶H7的O157抗原基因(rfbE基因)、鞭毛H7抗原基因(fliC基因)、粘附素基因(eaeA基因)和志贺样毒素Ⅰ、Ⅱ(SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因)为扩增对象,设计能导至目的片段大小不同的5对引物,通过优化条件,建立了可用于粪便检测的大肠杆菌5重PCR。结果在同一扩增体系中,检测了5株不同来源的大肠杆菌O157∶H7及27株非大肠杆菌O157∶H7细菌。结果表明,该方法能从2株大肠杆菌O157∶H7中扩增出rfbEf、liC、eaeA、SLT-Ⅰ、SLT-Ⅱ基因,它们的大小分别为582 bp、802 bp、487 bp3、68 bp和177 bp。而另外3株大肠杆菌O157∶H7也能扩增出除eaeA、SLT-Ⅱ基因外的其它3个基因片段。表明该方法可用于检测大肠杆菌O157∶H7,还可检测细菌是否含有毒素基因。在检测27株非大肠杆菌O157∶H7,除O149出现SLT-II扩增产物和O1∶H7出现fliC基因扩增产物外,其它非大肠杆菌O157∶H7的扩增结果均为阴性,表明该方法有较高的特异性。当粪便样品经增菌培养12 h,用该5重PCR体系能检测出最初接种量为5cfu/g粪便的样品。结论本5重PCR方法具有较高的特异性和敏感性,可迅速、有效地将大肠杆菌O157∶H7与其它非大肠杆菌O157∶H7相区别,同时还能检测O157∶H7中的毒力因子。因此,通过进一步研究,本方法有望应用于临床大肠杆菌O157∶H7感染的辅助诊断。 展开更多
关键词 大肠杆菌o157 h7 pcr rfbE基因 fliC基因 eaeA基因 SLT-Ⅰ基因 SLT-Ⅱ基因
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来自腹泻合并急性肾衰病人疫区的99株E.coli O157∶H7的鉴定结果分析 被引量:3
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作者 夏胜利 张锦 +1 位作者 陈振东 郭秋生 《疾病监测》 CAS 2002年第12期448-452,共5页
目的调查研究河南省2000年3月17日-7月6日发生的腹泻合并急性肾衰病人的致病菌。方法采集病人、外环境、家畜和家禽标本620份,采用免疫磁珠集菌法、CHROMAGAR-O157∶H7显色培养基分离及营养肉汤增菌、rfbO157、rfbO111引物多重PCR扩增... 目的调查研究河南省2000年3月17日-7月6日发生的腹泻合并急性肾衰病人的致病菌。方法采集病人、外环境、家畜和家禽标本620份,采用免疫磁珠集菌法、CHROMAGAR-O157∶H7显色培养基分离及营养肉汤增菌、rfbO157、rfbO111引物多重PCR扩增等方法进行病原菌的检测。结果分离出99份E.coli O157∶H7菌株,其中rfbO157、志贺氏样毒素2(stx2)、溶血素(hlyA)、肠上皮细胞纤毛消除素(eaeA)基因和vero细胞毒性试验均阳性的有56株,其它基因组合7株,36株无毒力基因。结论99株E.coli O157∶H7在CHROMAGAR-O157∶H7显色培养基生长形态、颜色,生化反应及毒力基因表现等方面出现多样化,对于今后在制定对该菌的诊断标准、传染源的控制及细菌毒力学等方面的研究提供了依据。 展开更多
关键词 腹泻 急性肾衰 合并症 致病菌 E.coli o157:h7 免疫磁珠 多重pcr 毒力基因
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Prevalence of shiga toxins(stx_1,stx_2),eaeA and hly genes of Escherichia coli O157:H7 strains among children with acute gastroenteritis in southern of Iran 被引量:2
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作者 Mohammad Kargar Maryam Homayoon 《Asian Pacific Journal of Tropical Medicine》 SCIE CAS 2015年第1期24-28,共5页
Objective:To survey the prevalence severe diarrhea arising from these bacteria in children under 5 years old in Marvdasht.Methods:In this study faecal sample from 615 children aged <5years old who were hospitalized... Objective:To survey the prevalence severe diarrhea arising from these bacteria in children under 5 years old in Marvdasht.Methods:In this study faecal sample from 615 children aged <5years old who were hospitalized lor gastroenteritis in Fars hospitals in Iran were collected and then enriched in Escherichia coli(E.coli) broth and modified tryplone soy broth with novobiocin media,fermentation of sorbitol,lactose and β— glucoronidase activity of isolated strains was examined by CT—SMAC,VRBA and chromogenic media respectively.Then isolation of E.coli O157:H7 have been confirmed with the use of specific antisera and with multiplex PCR method presence of virulence genes including:xtx_1.stx_2,eae.A.hly has been analyzed.Results:E.coli O157:H7 was detected in 7(1.14%) stool specimens.A significanl difference was seen between detection rale of isolated bacteria from age groups 18-23 months and other age groups(P=0.004).Out of considered virulence genes.only 1 of the isolated strains(0.16%)he stx,and eaeA genes were seen and also all isolated hacleria had resistance to penicillin,ampicillin and erythromycin antibiotics.Conclusions:We found thai children < 2 years of age were at highest risk of infection with E.coli O157:H7.Regarding severity of E.coli O157:H7 pathogenesis,low infectious dose and lack of routine assay for detection ol these bacleria in clinical laboratory,further and completed studies on diagnosis and genolyping of this E.coli O157:H7 strain has been recommended. 展开更多
关键词 ESChERIChIA coli o157:h7 Acute GASTRoENTERITIS VIRULENCE GENES Multiplex pcr
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大肠杆菌O_(157)多重PCR快速检测方法的建立 被引量:3
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作者 孙洋 冯书章 +2 位作者 郭学军 刘军 祝令伟 《中国兽医杂志》 CAS 北大核心 2008年第12期20-23,共4页
关键词 大肠杆菌o157 快速检测方法 多重pcr 出血性大肠杆菌 o157:h7 E.coli EhEC 血小板减少
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牛源大肠杆菌O157∶H7的分离鉴定
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作者 王雨朦 张桃 +4 位作者 丁浩 齐文静 何国文 苏战强 况玲 《中国畜牧兽医》 CAS 北大核心 2016年第10期2780-2785,共6页
为调查新疆部分地区E.coli O157∶H7的感染情况和菌株致病性,从新疆阿克苏、伊犁、塔城3个地区的牛场采集新鲜粪样564份,对E.coli O157∶H7进行分离与鉴定。利用E.coli营养肉汤(EC肉汤)对样品进行增菌后,用山梨醇麦康凯培养基(SMAC)平... 为调查新疆部分地区E.coli O157∶H7的感染情况和菌株致病性,从新疆阿克苏、伊犁、塔城3个地区的牛场采集新鲜粪样564份,对E.coli O157∶H7进行分离与鉴定。利用E.coli营养肉汤(EC肉汤)对样品进行增菌后,用山梨醇麦康凯培养基(SMAC)平板选择性培养,再经过4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸苷培养基(MUG)的筛选,对疑似菌株进行生化和PCR鉴定,并将分离鉴定到的菌株进行小鼠攻毒试验。结果显示,从伊犁地区采集的样品中共分离出2株E.coli O157∶H7(Y166和Y226),其检出率为0.88%;小鼠攻毒试验中,Y166和Y226试验组小鼠在48h内全部死亡,具有一定致病性;从阿克苏、塔城所采样品中未分离到E.coli O157∶H7。 展开更多
关键词 E.coli o157h7 分离鉴定 pcr 致病性
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检测冻肉中大肠杆菌O157∶H7的两种方法比较 被引量:4
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作者 谢海燕 朱燕秋 +4 位作者 杨德胜 崔剑峰 温清萍 李玉娥 郭霄峰 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2007年第2期83-84,共2页
关键词 大肠杆菌o157:h7 检测 冻肉 出血性大肠杆菌 大肠杆菌0157 E.coli 血小板减少 pcr技术
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大肠杆菌O157SYBR GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立及初步应用 被引量:2
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作者 朱启 朱启 +2 位作者 戴贤君 章铁锋 张菊芳 《黑龙江畜牧兽医》 CAS 北大核心 2009年第5期91-92,共2页
肠出血性大肠埃希菌O157:H7(E.coli O157:H7)是一种强致病的病原性细菌,可引起出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等。E.coli O157:H7对人的致病力较强,感染剂量较低,每克感染载体... 肠出血性大肠埃希菌O157:H7(E.coli O157:H7)是一种强致病的病原性细菌,可引起出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等。E.coli O157:H7对人的致病力较强,感染剂量较低,每克感染载体含菌10个以上即可能引起感染。感染此病菌的人会出现严重腹泻、发烧等症状,病情严重者更会引起肾脏衰竭并发症,甚至导致死亡,我国部分地区在食品和动物中有此类检测方面的报道。 展开更多
关键词 大肠杆菌o157 pcr检测方法 Green SYBR 实时定量 大肠埃希菌o157:h7 E.coli o157:h7
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基于大肠埃希菌O157∶H7的荧光定量冻干检测试剂盒的研制
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作者 粟元 朱龙佼 +2 位作者 曹继娟 刘建龙 许文涛 《生物技术通报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第3期264-275,共12页
大肠埃希菌O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7,E.coli O157∶H7)作为一种食源性致病菌,其分布广泛、危害性大。为了研制一种基于E.coli O157∶H7的既能实现快速、简单和灵敏检测,又能够实现常温储存及运输的试剂盒,本研究利用实时荧... 大肠埃希菌O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7,E.coli O157∶H7)作为一种食源性致病菌,其分布广泛、危害性大。为了研制一种基于E.coli O157∶H7的既能实现快速、简单和灵敏检测,又能够实现常温储存及运输的试剂盒,本研究利用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)技术,结合真空冷冻干燥技术,研制了保留核酸检测性能、易于常温储存及运输、减少气溶胶污染的E.coli O157∶H7荧光定量冻干检测试剂盒。研制的试剂盒采用冻干技术保留了核酸扩增试剂的检测性能,复水后,在Taq DNA聚合酶的作用下通过循环扩增实时监测荧光信号的积累,实现荧光定量检测,所提出的方法在40 min内可检测到2.1 copies/μL的eaeA基因。该技术为E.coli O157∶H7的检测提供良好的研究基础和技术参考,填补了市场灵敏度高、便于储存的E.coli O157∶H7检测试剂盒的缺乏。 展开更多
关键词 E.coli o157h7 核酸 荧光定量pcr 冻干保护剂 试剂盒
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肠出血性大肠杆菌O157∶H7紧密黏附素免疫保护性片段的基因克隆与表达 被引量:9
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作者 易勇 邹全明 +4 位作者 程建平 毛旭虎 曾明 朱永红 童文德 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第2期142-145,共4页
目的 克隆表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 5 7∶H7紧密黏附素 (intimin)免疫保护性片段 (intiminC30 0 )。方法 设计引物采用PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增紧密黏附素及其免疫保护性片段的编码基因eae与eaeC30 0 ,T A克隆后构建原... 目的 克隆表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 5 7∶H7紧密黏附素 (intimin)免疫保护性片段 (intiminC30 0 )。方法 设计引物采用PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增紧密黏附素及其免疫保护性片段的编码基因eae与eaeC30 0 ,T A克隆后构建原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测。结果 PCR法自EHECO1 5 7∶H7基因组扩增出了约 2 80 0bp和 90 0bp的目的片段 ;原核表达质粒pET 2 8a(+) eae及pET 2 8a(+) eaeC30 0经酶切及测序鉴定与预期序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5 %和 30 %;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 96× 1 0 3和 35× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白均以包涵体形式表达。结论 EHECO1 5 7∶H7紧密黏附素免疫保护性片段经基因克隆后获得了较高的表达量 ,为进一步的生物学性质及免疫学特性研究奠定了基础。 展开更多
关键词 肠出血性大肠杆菌o157:h7 免疫保护性 基因克隆 黏附素 片段 BL21(DE3) 原核表达质粒 E.coli 基因组扩增 EhEC 相对分子质量 pcr PAGE T-A克隆 蛋白表达率 生物学性质 克隆表达 设计引物 编码基因 诱导表达 特性研究
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Stx2B与IntiminC300融合蛋白的构建、表达及免疫保护研究 被引量:13
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作者 易勇 邹全明 +6 位作者 程建平 毛旭虎 童文德 曾明 朱永红 马颖 王庆旭 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2005年第3期227-233,共7页
目的 构建表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 57∶H7志贺毒素Ⅱ结合亚单位 (Stx2B)与紧密黏附素C 端免疫保护性片段 (IntiminC30 0 )的融合蛋白 (Stx2B IntiminC30 0 ) ,并观察其免疫保护作用。方法 设计引物采用PCR法自EHECO1 57∶H7基... 目的 构建表达肠出血性大肠杆菌 (EHEC)O1 57∶H7志贺毒素Ⅱ结合亚单位 (Stx2B)与紧密黏附素C 端免疫保护性片段 (IntiminC30 0 )的融合蛋白 (Stx2B IntiminC30 0 ) ,并观察其免疫保护作用。方法 设计引物采用PCR法自EHECO1 57∶H7基因组扩增Stx2B的编码基因stx2b ,T A克隆后在前期已构建原核表达质粒 pET 2 8a( + ) eaeC30 0的基础上构建融合基因表达质粒 pET 2 8a( + ) stx2b eaeC30 0 ,经测序鉴定后转化E .coliBL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,PAGE检测 ;通过包涵体洗涤与阴离子柱层析纯化 ,获得目的蛋白Stx2B IntiminC30 0 ,以Al(OH ) 3为佐剂皮下注射免疫BALB/c小鼠 ,再以EHECO1 57∶H7超声破菌液腹腔注射免疫后的小鼠 ,观察攻毒保护效果。结果 PCR法自EHECO1 57∶H7基因组扩增出了约 2 90bp的目的片段 ;原核表达质粒 pET 2 8a( + ) stx2b eaeC30 0经酶切及测序鉴定与设计序列一致。转化E .coliBL2 1 (DE3)后IPTG诱导目的蛋白表达率约 2 5% ;PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量 (Mr)约 4 3× 1 0 3,破菌后电泳证实目的蛋白以包涵体形式表达。纯化后目的蛋白Stx2B IntiminC30 0的纯度达 75% ,免疫BALB/c小鼠后血清特异性抗体阳转率及抗体效价均显著增高 ,能够抵御致死剂量EHECO1 57∶H7超声破菌? 展开更多
关键词 融合蛋白 o157:h7志贺毒素 保护研究 BALB/c小鼠 表达及 BL21(DE3) 肠出血性大肠杆菌 原核表达质粒 EhEC 免疫保护性 基因组扩增 免疫保护作用 基因表达质粒 E.coli E.coli 相对分子质量 免疫保护效果 pcr PAGE T-A克隆
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