EtMIC-2表达产物对鸡三种艾美耳球虫的保护试验

鸡艾美耳球虫病由隶属顶复门7种艾美耳球虫（E.tenella、E.necatrix、E.acervulina、E.maxima、E.brunetti、E.praecox、E.mitis）引起,常混合感染,有很高的发病率和死亡率,轻者则影响鸡的增重和饲料转化率。微线是顶器的结构之一,位于子孢子和裂殖子前端,EtMIC-2是其50 kDa左右的酸性蛋白,在虫体入侵时表达,该蛋白可能在虫体入侵时起重要作用。用Pet载体经原核表达该蛋白,7、14日龄经口服、肌注不同剂量工程活菌和菌体裂解蛋白二次免疫鸡,免疫后1周用3种艾美耳球虫（E.tenella、E.acervulina、E.maxima）攻虫,发现相对增重率随菌体蛋白含量增加呈现增强趋势,E.tenella攻虫表现最有效的是口服PBS200μg活菌组为96％,E.ac-ervulina、E.maxima分别为96％、87％。从攻虫后7～14 d卵囊排出曲线看,每天排卵囊数和相对卵囊产量均低于红对照;相对卵囊产量,E.tenella攻虫后,口服PBS 200μg活菌组最低,为17％,E.acervulina、E.maxima攻虫后,口服PBS 200μg裂解菌组最高,分别为90％、93％。从增重与卵囊产量来看,EtMIC-2对E.tenella、E.ac-ervulina和E.maxima这3种球虫有一定的免疫保护作用,尤其口服200μgPBS活菌时,对E.tenella保护作用最明显。说明来源于E.tenella子孢子的Etmic-2基因的表达产物对E.tenella、E.

柔嫩艾美耳球虫重组IL-2-EtMIC-2质粒的免疫效力研究

为了确定鸡IL-2对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)河北株Et MIC-2质粒的免疫增效作用,将构建的pcDNA3.0-IL-2、pcDNA3.0-EtMIC-2和pc DNA3.0-IL-2-EtMIC-2质粒分别免疫雏鸡,研究其对E.tenella攻毒后的免疫保护效果。结果显示,pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2重组质粒的免疫剂量为100μg、150μg时,抗E.tenella攻击的保护率均高达95%,抗求虫指数(ACI)分别为163和165,比免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组分别提高了91.99%、94.35%和31.88%、33.50%。

鸡柔嫩艾美耳球虫微线蛋白(Etmic-2)与鸡泛素融合蛋白基因的DNA疫苗表达载体的构建

本文用RT_PCR技术从鸡的肌肉组织中扩增出泛素 (ubiquitin_Ub)编码基因 ,再将其定向克隆到真核表达载体pCMV_Script中多克隆位点的BamHⅠ、HindⅢ之间 ,构建成重组质粒pCMV_Ub。经酶切和测序确定为正确后 ,再将来源于E .teella裂殖子的Etmic_2基因克隆到pCMV_Ub质粒中Ub基因下游的SalⅠ位点上 ,经酶切鉴定 ,获得编码Etimc_2基因的真核表达载体pCMV_Ub_mic_2。该载体中的Etmic_2基因与Ub融合表达 ,并将用于DNA疫苗免疫鸡 ,希望融合了Ub的Etmic_2蛋白能更有效的进入MHC_Ⅰ循环 。

柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中的Etmic-2基因克隆及测序

作者根据子孢子微线基因 (Etmic- 2 )的 c DNA序列 ,利用计算机设计出 1对引物 ,从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子中用 RT- PCR技术扩增出 1个片段 (m ic2 - m z)。把这个片段克隆到 p GEM- T- Easy Vector中后 ,我们得到 1个阳性克隆 pmic2 - mz,酶切分析证明 pm ic2 - m z含有 m ic2 - m z,并且外源片段以反方向插入 T载体中。核苷酸序列测定结果表明 m ic2 - m z与 Etmic- 2基因的编码区序列一样长 ,分子量都为 112 7bp,并且两序列之间也只有 3个碱基不同 ,也没有造成氨基酸编码错位 ,这说明球虫从子孢子到第二代裂殖子的二次无性生殖过程中 ,微线基因Etm ic- 2 c NDA序列没有发生太大的变化。

ETMIC-2基因表达产物对人工感染柔嫩艾美耳球虫雏鸡的保护及病理学研究

采用大肠杆菌表达鸡艾美耳球虫微线蛋白(ETMIC 2),对石歧杂小公雏在1、2周龄按分组以不同剂量分别肌注免疫,3周龄人工感染强毒柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,4周龄全部捕杀,进行增重、盲肠病变和免疫淋巴器官病理组织学观察。结果表明,全部试验组增重率均高于红对照组,其中两组超过白对照组;盲肠病变均低于红对照组;免疫淋巴器官发生不同程度的增生,尤其是胸腺,盲肠扁桃体及脾脏,淋巴滤泡增大,淋巴细胞明显增殖。此结果可以提示,适量的ETMIC 2基因表达产物免疫雏鸡后,再进行柔嫩艾美耳球虫的强毒攻击,能刺激机体的免疫淋巴组织器官产生免疫应答反应,对机体具有较好的保护力。

鸡球虫微线基团Etmic-2的一种蛋白异形体的发现

本文利用PCR技术 ,分别从柔嫩艾美耳球虫的第二代裂殖子和孢子化卵囊基因组DNA中扩增出微线蛋白EtMIC 2基因序列 ,并进行了克隆和核苷酸序列测定。核苷酸序列表明Etmic 2基因包含有二种cDNA序列 ,并含有 3个内含子 ,每一个内含子都有真核生物内含子典型剪切共有序列 (GT/AG)。与二种cDNA序列比较发现 ,Etmic 2基因的 pre mRNA可以通过内含子的 3’端的不同剪切位点而产生不同的mRNA ,生成至少两种蛋白异形体。本文从基因序列上解释了EtMIC 2蛋白的二种蛋白异形体产生过程。

E.tenella河北株重组IL-2-EtMIC-2 DNA疫苗的构建及保护力分析

为了构建E．tenella河北株重组IL-2-EtMIC-2DNA疫苗，并确定其抗球虫效力。采用RT-PCR方法分别克隆出鸡IL-2和E．tenella河北株EtMIC-2基因，并连接到pMD18-T载体上进行测序；将目的基因克隆到pcDNA3．0载体，构建重组质粒peDNA3．0-IL-2-EtMIC-2，并转染293T细胞，用Westernblot方法验证表达。将构建的重组IL-2-EtMIC-2DNA疫苗以50，100，150ug／只的剂量分别在14，21日龄胸肌注射免疫试验鸡，除阴性对照组外，28日龄时经口灌服孢子化E．tenella卵囊4×10 4个，研究其对E．tenella感染后的免疫保护效果。结果表明：成功构建了重组质粒pcDNA3．0-IL-2-EtMIC-2，且能在293T细胞中表达出融合蛋白；3个免疫组的ACI比阳性对照组分别提高了97．63％，127．02％和129．81％，其中免疫剂量为100，150ug时，ACI均达160以上，具有良好的免疫保护效果。

鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC-2基因真核表达载体的构建及其在Hela细胞中的表达

根据GenBank发表EtMIC-2序列设计1对特异性引物,通过PCR技术扩增EtMIC-2基因,将该基因与真核表达载体pVAX1连接,构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,并用脂质体介导法将其转染Hela细胞。然后通过间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western-blot分析检测EtMIC-2蛋白在转染细胞中的表达情况。经测序和序列分析,成功扩增获得了EtMIC-2基因,并成功构建了重组真核表达载体pVAX1-EtMIC-2,Western-blot和IFA表明EtMIC-2蛋白在Hela细胞中得到表达。该结果为柔嫩艾美耳球虫核酸疫苗的研究奠定基础。

E.tenella河北株pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2真核表达载体的免疫调节作用

为了研究柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)河北株真核表达载体pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2的免疫调节作用,将240只14日龄雏鸡随机分成8组,第1,2组分别为阳性、阴性对照,在14,21 d,3、4组分别肌注100μg的pcDNA3.0-IL-2、pcDNA3.0-EtMIC-2;5、6、7组分别肌注50,100,150μg的pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2;8组21 d时滴口免疫鸡球虫病四价活疫苗。28 d,阳性对照组和6个试验组每只鸡经口攻毒4×10~4个E.tenella卵囊,阴性对照组每只鸡灌服同体积的生理盐水。结果显示:当pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2真核表达载体的免疫剂量达100,150μg/只时,试验后7,21,28 d IgG的含量、7 d的IgA含量和21,28 d的IFN-γ含量均显著高于阴性对照组、阳性对照组、单独免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组(P<0.05);试验后28 d,血清中IL-2的含量显著高于阴性和阳性对照组(P<0.05),与单独免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组相比差异不显著(P>0.05);试验后7,14,21,28 d脾脏IL-2和IFN-γmRNA表达量均显著高于阳性对照组、单独免疫pcDNA3.0-IL-2和pcDNA3.0-EtMIC-2组(P<0.05)。综上所述,IL-2可增强EtMIC-2基因的免疫原性,适量的真核表达载体pcDNA3.0-IL-2-EtMIC-2可显著提高感染柔嫩艾美尔球虫雏鸡的免疫功能。

E.tenella河北株EtMIC-2基因的克隆及毕赤酵母系统表达

为表达鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)河北株EtMIC-2蛋白,本试验采用RT-PCR方法克隆出E.tenella河北株EtMIC-2基因,连接到毕赤酵母分泌表达载体pPIC9中,构建重组表达载体pPIC9-EtMIC-2。将其线化后转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达,饱和硫酸铵4℃沉淀浓缩后,用His选择镍-亲和层析柱纯化EtMIC-2蛋白。采用SDS-PAGE和Western blot方法验证其蛋白的表达。结果表明,构建的重组表达载体pPIC9-EtMIC-2在毕赤酵母菌中表达出相对分子质量约为45 000的目的蛋白,表达的EtMIC-2蛋白能被E.tenella阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。为进一步研究EtMIC-2蛋白功能及构建DNA疫苗奠定基础。

E.tenella河北株EtMIC-2基因克隆及生物信息分析

利用RT-PCR技术扩增出柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）河北株EtMIC-2基因,将该基因克隆入pMD19-T载体,进行测序、序列分析与蛋白结构预测。测序显示该基因全长为1 029bp,含有1个1 029bp开放阅读框（ORF）,编码342个氨基酸。该基因与E.tenella杂交株（ZJ）、北京株（BJ）、广东株（GD）、豪顿株（HD）、GenBank上发表的EtMIC-2基因以及布氏艾美耳球虫的MIC-2基因核苷酸序列同源性分别为99.1%、99.7%、99.6%、99.6%、99.8%和40.6%;与其基因编码的氨基酸序列同源性分别为97.7%、99.1%、98.8%、99.1%、99.4%和38.5%。蛋白结构预测显示该蛋白相对分子质量为35 000,理论等电点PI为4.47,包括4 893个原子,分子式C1500H2429N431-O528-S5,丝氨酸（Ser）在20种氨基酸中所占的比例最高,达12.0%,稳定系数为42.19,脂肪系数为77.05;信号肽的位置为前22个氨基酸;空间结构具有17个α螺旋,19个β折叠,15个转角,24处无规则卷曲;只有1个较强疏水位点（大约在第8-11氨基酸处）,没有跨膜区域。

TA4和Et MIC-2表达产物免疫后对感染柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)鸡增重和盲肠卵囊数的影响

实验用Etmic- 2和ta4两种基因的表达产物经口服、肌注免疫鸡 ,然后用柔嫩艾美耳球虫攻击免疫鸡 ,以观察重组产物的免疫保护作用。结果表明 ,免疫鸡的增重均高于红对照 ,口服两种活菌 2 0 0 μg组最佳 ,其相对增重为 96 .5 4 % ,其它组为 77.0 7%～ 90 .30 %。从盲肠卵囊数看 ,同样是口服两种活菌各 2 0 0 μg组最佳 ,相对卵囊产量为 16 .5 8% ,其它均有降低 ,为 17.72 %～ 94 .0 8%。从增重与卵囊产量来看 ,两种重组表达产物对E .tenella球虫有一定的免疫保护作用 。