戊型肝炎病毒在人胚肺二倍体细胞KMB17等传代细胞中的繁殖

目的探索戊型肝炎病毒(HEV)敏感细胞及体外培养条件,为HEV体外研究提供基础。方法用戊肝患者急性期阳性粪便悬液感染恒河猴进行毒种的扩增与活化,超速离心处理猴阳性粪便标本获取培养用毒种,将其接种于各种人源性细胞(包括人胚肺二倍体细胞KMB17、人肺癌细胞A549、人肝癌细胞BEL7402、人宫颈癌细胞Hela)和非人灵长类细胞(非洲绿猴肾细胞Vero),通过细胞病变观察、RT-PCR检测及免疫荧光实验来判定细胞是否对HEV敏感。结果KMB17、A549、BEL7402细胞中第一代传代7～9d出现细胞病变,11～13d脱落,传至10代仍可经正链和负链RT-PCR检测到HEV基因组正链RNA和复制的负链RNA的存在,而Hela、Vero细胞未见细胞病变,分别于2～4代后经RT-PCR不能扩增到特异片段。在KMB17细胞培养体系中经免疫荧光实验表明实验组有明显荧光着色,病毒捕获RT-PCR扩增到特异片段。结论在采用的培养条件下,KMB17、A549、BEL7402细胞对HEV敏感,而Hela、Vero细胞不敏感,本研究建立了一定代次内HEV组织培养体系。

^(99)Tc^m-N(NOEt)_2在KMB17人胚肺二倍体细胞与不同种类肺癌细胞中的摄取动力学比较

背景与目的PET/CT显像价格昂贵,因此研究适合SPECT/CT的肿瘤显像剂显得尤为重要。99Tcm-N(NOEt)2[99Tcm-氮-二(N-乙基-N-乙氧基二硫代氨基甲酸盐)]可被肺肿瘤细胞等摄取。本文旨在细胞水平对比研究其在KMB17人胚肺二倍体成纤维细胞与多种肺癌细胞中的摄取动力学差异,探讨99Tcm-N(NOEt)2显像对肺肿瘤的鉴别诊断价值。方法在等体积且细胞浓度为1×106/mL的YTMLC个旧人肺鳞癌细胞、SPC-A1人肺腺癌细胞、AGZY低转移人肺腺癌细胞、973人高转移肺腺癌细胞、GLC-82个旧人肺腺癌细胞以及KMB17人胚肺二倍体成纤维细胞的混悬培养液中分别加入等量99Tcm-N(NOEt)2,按300μL精确取样分装于试管中,37oC恒温培养,均分别于5min、15min、30min、45min、60min、75min、90min离心沉淀,测定细胞内放射性计数,计算各时间点各种细胞对99Tcm-N(NOEt)2的摄取百分率。结果6种细胞除SPC-A1细胞与973细胞之间的差异无统计学意义外(LSD-t检验,P=0.838),其余两两之间的差异均有统计学意义(P<0.001);细胞的摄取率大小关系为:973与SPC-A1>YTMLC>GLC-8->AGZY>KMB17;30min-45min时摄取率逐渐趋于平稳,45min摄取率均大于其摄取峰值的96.6%。结论99Tcm-N(NOEt)2显像在肺肿瘤的鉴别诊断中有一定的临床应用价值,且早期显像在30min左右是适合的。

悬浮吸附法在人胚肺二倍体细胞(KMB17)中培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒

目的研究在KMB17细胞中培养脊髓灰质炎减毒活疫苗病毒及其用于生产疫苗的可行性。方法应用悬浮吸附和添加血清的方法,在KMB17细胞上培养SabinⅠ、Ⅱ、中Ⅲ2型病毒,用微量法检测病毒滴度。结果在悬浮吸附加10%血清培养条件下,SabinⅠ滴度可达8.125 LgCCID50,SabinⅡ滴度可达7.5 LgCCID50,中Ⅲ2滴度可达7.583 LgCCID50。与传统的猴肾原代细胞培养的病毒滴度比较,差异无显著意义(P>0.05)。结论可进一步研究应用KMB17细胞进行疫苗生产。

肠道病毒EV71相关受体在人二倍体细胞KMB17表面的构成分析

目的研究人二倍体细胞KMB17表面与肠道病毒EV71感染相关的受体Toll样受体4(TLR4)、血小板衍生生长因子受体α多肽(pDGFR-αR1)的表达情况,以及细胞周期、细胞代次、EV71感染对这两种受体表达的影响。方法使用荧光标记的特异抗体:PE-TLR4、FITC-PDGFR-αR1标记不同细胞代次、处于不同细胞周期时段的KMB17细胞,应用流式细胞仪检测表达这两种受体蛋白的阳性细胞率,以及EV71感染前后,阳性细胞率的变化。使用NCBI primer blast设计TLR4、PDGFR-αR1特异的引物,提取不同细胞代次、细胞周期时段KMB17细胞的RNA,使用real-timePCR检测这些受体蛋白特异mRNA的量。结果 KMB17细胞在使用血清饥饿法进行G0/G1同步化后约22h进入S期,在36h进入G2期,在48h左右完成分裂。PDGFR-αR1、TLR4平均阳性细胞的比例分别为4.47%和11.82%;通过流式细胞仪检测,在G0/G1期,PDGFR-αR1、TLR4的平均阳性细胞比例分别为4%和8.9%;在S期,分别为2.6%和9%;在G2/M期,分别为4.4%和13.5%;EV71病毒感染后,PDGFR-αR1阳性的细胞比率由2.6%上升至4.0%,TLR4阳性细胞比率分别为11.6%和12.8%。结论人二倍体细胞KMB17表面表达肠道病毒相关的受体TLR4和PDGFR-αR1,表达PDGFR-αR1的阳性细胞较TLR4少,不同代次的KMB17细胞这2种受体阳性细胞比例的差异不大,PDGFR-αR1阳性细胞在G0期较多,TLR4阳性细胞在G2/M期较多;EV71病毒感染后,PDGFR-αR1、TLR4阳性细胞的比率变化不大,表明这两种受体分子在KMB17细胞表面表达较稳定,不受EV71感染的影响。

KMB17人胚肺二倍体成纤维细胞与多种肺癌细胞摄取^(99)Tc^m-MIBI的对比研究

目的比较亲肿瘤显像剂99Tcm-甲氧基异丁基异腈(MIB)I在人胚肺二倍体成纤维细胞KMB17与多种肺癌细胞中的摄取情况,从细胞水平研究99Tcm-MIBI显像对肺肿瘤诊断和鉴别诊断价值的理论依据。方法在等体积且细胞浓度为1×106/mL的YTMLC个旧人肺鳞癌细胞、SPC-A1人肺腺癌细胞、AGZY低转移人肺腺癌细胞、973人高转移肺腺癌细胞、GLC-82个旧人肺腺癌细胞以及KMB17人胚肺二倍体成纤维细胞的混悬培养液中分别加入等量99Tcm-MIBI,按300μL精确取样分装于试管中,37℃恒温培养,均分别于5、15、30、45、60、75及90min时离心沉淀、测定细胞内放射性计数,计算各时间点各种细胞对99Tcm-MIBI的摄取百分率。结果6种细胞对99Tcm-MIBI摄取率有统计学差异,其摄取率大小关系为973>SPC-A1>GLC-82>AGZY>YTMLC>KMB17;30～45min时摄取率逐渐趋于平稳,45min摄取率均大于其摄取峰值的96.6%。结论99Tcm-MIBI对肺肿瘤的鉴别诊断有临床应用价值;且早期显像在30min左右是适合的。

不同类型胰蛋白酶消化Vero细胞和KMB-17细胞的比较

胰蛋白酶(trypsin)是贴壁细胞传代过程中必不可少的工具酶.研究比较了猪源胰蛋白酶、两种牛源胰蛋白酶和全合成胰蛋白酶TrypLE消化Vero细胞和KMB17细胞的效果,评价在疫苗生产中培养细胞的最佳消化工艺,以及在向伊斯兰国家及人群提供生物制品过程中存在的Halal(清真)验证中关于猪源胰蛋白酶的替代问题.首先,利用配置好的活力均为1400~1500 U/mL的猪源胰酶、牛源胰酶-1、牛源胰酶-2和全合成胰酶TrypLE试剂分别在37℃环境中消化细胞,采用荧光计数仪进行计数及活率检测.然后,将得到的细胞悬液稀释至2×10^(5)mL^(-1),接种至6孔板和96孔板中,在培养的不同时间绘制细胞生长曲线和检测细胞增殖及毒性.在筛选到可替代消化酶之后,进行10次重复实验.结果显示,Vero细胞消化实验中,猪源胰酶的消化能力相对其他胰酶较好,有显著差异,其中牛源胰酶-2消化细胞后对细胞增殖和毒性影响影响最大.KMB-17细胞消化实验中,4种消化酶的消化能力均无显著差异,消化时间存在显著差异(P<0.05),4种消化酶在48 h之后对KMB-17细胞增殖和毒性影响有明显差异.猪源胰酶、牛源胰酶-1和TrypLE消化Vero细胞后变异系数(CV)分别为1.08%、1.12%、1.22%;猪源胰酶和牛源胰酶-2消化KMB-17细胞后CV分别为1.15%、1.04%.为满足全球伊斯兰国家及人群对疫苗及生物制品使用的需求,可使用牛源胰酶-1和TrypLE替代猪源胰酶消化Vero细胞,消化KMB-17可使用牛源胰酶-2替代猪源胰酶.

HY6071及KMB28两型潜水装具性能特点分析

潜水装具是潜水员在水下完成作业任务所必需的特殊防护装备,其中HY6071型氦氧重潜水装具和KMB28型水面供气需供式潜水装具都可用于氦氧常规潜水。本文从结构组成、工作原理、基本性能等方面对HY6071型氦氧重潜水装具和KMB28型水面供气需供式潜水装具进行了分析比较,最后对这两种装具的使用提出了建议。

应用KMB17细胞培养柯萨奇病毒B族1、2、3型的研究

目的 采用人胚肺二倍体细胞(human embryonic lung diploid cell)KMB17株对柯萨奇病毒B族(Coxsackievirus B,CVB)1、2、3型进行适应性培养,探索应用KMB17细胞培养CVB1-3型病毒的相关参数,为基于KMB17细胞研发CVB多价疫苗提供参考。方法 将CVB 1-3型分别设置8个不同的感染复数(mulitiplicity of infection, MOI)梯度(0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4),在KMB17细胞上进行培养观察,对病毒培养结果进行统计分析。结果 CVB 1-3型病毒均能KMB17细胞中复制,并使细胞产生明显的细胞病变(cytopathic effect, CPE)。其中CVB 1型在KMB17细胞上适宜的种毒MOI值为0.25~0.3,病毒收获液的平均滴度为7.25 lgCCID50/mL,适宜MOI范围内病毒培养时间的95%置信区间为96.1~97.6 h;CVB 2型在KMB17细胞上适宜的种毒MOI值为0.20~0.25,病毒收获液平均滴度为7.375 lgCCID50/mL,适宜MOI范围内病毒培养时间的95%置信区间为74.8~76.8 h。CVB 3型在KMB17细胞上适宜的种毒MOI值为0.30~0.35,病毒收获液的平均滴度为7.25 lgCCID50/mL,适宜MOI范围内病毒培养时间的95%置信区间为82.7~84.7 h。结论 KMB17为一株理想的用于CVB1、2、3型培养的基质细胞,可为基于KMB17细胞研发CVB多价疫苗提供参考。

RD、KMB-17及Vero细胞对肠道病毒分离培养敏感性的比较

目的比较人横纹肌肉瘤细胞RD、人胚肺二倍体细胞KMB-17和非洲绿猴肾细胞Vero对肠道病毒(enterovirus,EV)分离培养的敏感性,以期为后续EV各基因型毒株的分离提供实验依据。方法收集2019年昆明市某医院确诊手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)患者粪便样本60份,分别采用RD、KMB-17和Vero细胞分离培养EV,并对阳性样本进行RT-PCR检测、测序及NCBI BLAST比对,鉴定EV基因型。结果共分离获得112株EV,分别属于11种基因型。其中RD细胞分离出26株Echo-11,6株Echo-6和Echo-30,2株CV-A4和CV-A10,1株CV-A6、CV-A16和Echo-18;KMB-17细胞分离出42株Echo-11,3株Echo-6和2株Echo-30;Vero细胞分离出6株CV-B1,5株CV-B3,4株Echo-11,3株CV-A16和1株CV-B2。结论RD细胞对大部分EV均敏感,KMB-17和Vero细胞分别对Echo和CV-B最敏感。

启发式进化规划求解Steiner树问题

求解 Steiner树对通信网络点对多点路由优化问题有重要意义 ,已被证明是 NP- complete的 .通过把图形简化技术、进化规划方法和 KMB启发式算法相结合 ,提出了一种求解 Steiner树问题的新方法 ,提高了算法的效率 .仿真结果表明 ,本算法是有效的 ,性能优于传统的启发式算法 .

伊氏锥虫在人胚肺成纤维细胞和在新生鼠肾成纤维细胞型细胞中的体外培养

在HEPES缓冲,含15—20％胎牛血清,100单位青霉素/ml,100微克链霉素/ml的RPMI-1640培养基中,用人胚肺成纤维细胞(KMB)和新生鼠肾成纤维细胞型细胞(ZUKF)作支持细胞,成功地使伊氏锥虫(Trypanosoma evansi)正常动基体株(kinetoplastic strain)和异常动基体株(dyskinetoplastic strain)在37℃含5％ CO_2的二氧化碳培养箱中连续培养达60天以上,并保持其对小鼠的高度感染力和致病力。这是迄今为止首次利用来源于人的细胞作支持细胞连续培养家畜非洲锥虫血液型成功的报告。实验结果表明伊氏锥虫体外培养成功与否对提供支持细胞的宿主是否有感染性无必然的联系。此外,利用Baltz氏等建立的无支持细胞培养系统,我们亦成功地使上述两伊氏锥虫株在体外连续繁殖,并保持对小鼠的高度感染力和致病力。

基于E-CARGO的在线社区多对多好友推荐机制研究

好友推荐机制是繁荣在线社区的有效手段,然而单纯为增加用户数及绑定用户关系的过于频繁的推荐方式会引起用户厌烦.为提升用户体验,本文以大型教学与科研协作平台学者网为研究背景,引入基于角色的协同模型ECARGO对推荐机制进行建模,将好友推荐转化为多对多指派问题,使用带回溯的Kuhn-Munkres算法(KMB)对好友推荐数与接纳数受限情况下最优推荐指派进行了研究与解决.仿真实验表明,该推荐机制友好、高效、精准,能完善在线社区推荐机制,对在线社会健康发展形成助力.

D60K Mb定点突变对肌红蛋白结构及荧光量子产率的影响

为了探究肌红蛋白表面60位的Asp突变为Lys后对蛋白荧光强度的影响,在模拟生理条件下,利用荧光法和圆二色法对WT Mb及D60K Mb的结构及荧光光谱特性进行了对照研究,结果表明D60K Mb的荧光量子产率远大于WT Mb。通过研究pH值和结构对荧光量子产率的影响,发现Mb 60位天冬氨酸(Asp)突变为赖氨酸(Lys)后,蛋白表面电荷发生改变,导致蛋白的荧光量子产率明显增强;同时使蛋白内部的芳香族氨基酸较原来更暴露,极性增强,激发态分子的去激发过程由原来的无辐射能量转移为主转变为辐射能量转移为主,最终导致荧光强度增强。

胞质分裂阻断法及染色体畸变实验检测水质诱变性及两种方法的比较

运用人胚肺细胞胞质分裂阻断法（ＣＹ－ＭＮＴ）及染色体畸变实验（ＳＣＡ）检测了某市水源水及自来水的遗传毒性，并比较了两短测实验方法和相应的反映细胞毒性的指标ＮＤＩ（ｎｕｃｌｅａｒｄｉｖｉｓｉｏｎｉｎｄｅｘ）和ＭＩ（ｍｉｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ）之间的关系。结果表明：该市的水源水及自来水中的有机提取物可不同程度地诱导微核率及染色体畸变率的升高，并且各实验剂量组与ＮＤＩ、ＭＩ有很好的负相关关系，源水的相关系数分别为－０．９０４、－０．９８０，自来水的相关系数分别为－０．８８２、－０．９１８，微核率（ＭＮＢＮ，Ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅａｔｅｄｂｉｎｕｃｌｅａｔｅｄ）与染色体畸变率（ＳＣＡ，Ｓｔｒｕ－ｔｕｒａｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌａｂｅｒａｔｉｏｎ）及ＮＤＩ与ＭＩ有很好的相关性，源水的相关系数分别为０．８８６、０．９５８，自来水的相关系数分别为０．９９４、０．９６０。

液压起升机构非线性动力学特性分析

本文建立了液压起升机构的含有刚度慢变参数的非线性多自由度动力学模型，并用模态分析和ＫＢＭ方法得到了系统非线性方程的一次及改进的一次近似解。作为比较，又采用数值方法求得系统方程的数值解。分析了液压系统的动态特性，为起升机构的设计提供理论依据。

人民币汇率对FDI的影响——基于VAR模型的动态分析

运用协整关系、误差修正模型实证研究了1980年～2009年人民币双边实际汇率对外商直接投资(以下简称FDI)流入的影响。研究结果表明:长期来看,人民币对美元升值不仅不会导致FDI流入的减少,反而能够促进FDI流入的增加;中国的开放度和政策稳定性使FDI流入呈现为显著的正向影响。

探讨管控一体化系统的发展策略及其在企业管理中的作用

本文针对承钢冶金现场的数据自动采集支持ERP系统以及对现场的网络视频监控,并实现企业信息资源共享,最终实现企业管控一体化的问题进行了探讨,对可行性和方案进行了论述,对提高企业自动化装备水平和信息化建设有着非常重要的意义。

KMB-17细胞株的遗传稳定性

目的研究连续传代的KMB-17细胞株的遗传稳定性。方法将第23代KMB-17细胞连续传代至60代,按常规染色体分析方法,观察不同代次细胞的染色体数目和结构变化。选取核基因组和线粒体基因组中高突变的15个STR位点,经PCR扩增和电泳分析微卫星不稳定性。结果KMB-17细胞株经连续传代培养至56代仍未发生染色体数目和结构改变,微卫星位点也未发生突变。结论KMB-17细胞株连续传代培养后,仍能保持细胞生物学特征及遗传特征的稳定,40代以前的细胞作为疫苗生产基质是安全的。

KMB_(17)细胞培养流感病毒的实验研究

探讨了流感病毒在KMB17细胞上培养的可行性.将3株不同型别的流感病毒(A/Wisconsin/67/2005H3N2,A/New Caledonia/20/1999 H1N1和B/Malaysia/2506/2004)分别接种于KMB17细胞上,在无血清的条件下于不同pH值和不同胰酶浓度的维持液中35℃培养72 h后收获病毒,测定血凝效价.实验结果表明,所用的3个毒株中的H3N2亚型毒株(A/Wisconsin/67/2005 H3N2)血凝效价明显高于另外的H1N1亚型(A/NewCaledonia/20/1999 H1N1)和B型(B/Malaysia/2506/2004)毒株.因此认为KMB17细胞可作为培养流感病毒的备选培养基质.

人二倍体细胞株KMB-17细胞代次检测模型的建立

目的建立人二倍体细胞株KMB-17细胞代次与端粒长度之间的关系模型。方法将KMB-17细胞按照1∶2的分种率连续传代,以传代后再长满瓶为1代,取第22、25、28和30代KMB-17细胞,提取基因组DNA,采用实时荧光定量PCR法检测端粒重复拷贝数(T)及单个拷贝基因(S),以T/S值表示不同代次KMB-17细胞的端粒长度。结果第22、25、28和30代KMB-17细胞的T/S值分别为1 224±48、818±86、671±118和505±41,T/S值随细胞代次的增加而降低。结论 KMB-17细胞代次与细胞端粒长度间具有明显相关性,即细胞代次越高,细胞端粒长度越短。