欧洲型PRRSV RT-PCR检测方法的建立及ORF7基因序列比较

根据PRRSV（LV株）ORF7基因设计一对引物，建立了欧洲型PRRSV的RT-PCR检测方法。通过对50份组织病料检测及其ORF7基因序列分析，结果表明，有4份组织病料扩增出欧洲型PRRSV576bp特异性片段，阳性率为8％，其ORF7基因序列和氨基酸推导序列与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株（AMER-VAC-PRRS）的同源性分别在99．0％～99．7％和98．5％～100％之间，而与标准毒株（LV）的同源性分别在95．9％～96．6％和96．99，6～97．7%之间。表明该PT-PCR体系适合组织病料中欧洲型PRRSV的直接检测，同时也证实了欧洲型PRRSV在我国的存在，并且与疫苗株之间具有较高的同源性。

欧洲型PRRSV的分离鉴定及其ORF5基因序列分析

采自福建省规模化猪场的疑似病料进行PRRSV分离鉴定,采用RT-PCR方法扩增PRRSV ORF5全基因并进行序列测定分析。从采集的病料中成功分离2株PRRSV,2株分离毒株ORF5与Gen Bank中选择的参考毒株比较发现,其核苷酸同源性为82.5%~90.6%,氨基酸同源性为80.6%~91.5%。通过序列进行系统进化分析均显示分离毒株属于欧洲型PRRSV,ORF5基因与LV相比变异较大,应加大对欧洲型PRRSV的监控。

欧洲型PRRSV弱毒株全长基因组cDNA克隆的构建与分析

为了获得欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3全基因组序列和病毒基因组全长cDNA克隆,通过RT-PCR技术扩增了AMERVAC-PRRS/A3弱毒株的全基因组,并对基因组cDNA序列进行了测定。根据测序结果,选择合适的酶切位点将各个亚克隆产物逐段克隆入改造过的pBluescriptⅡKS(+)载体中,从而获得了病毒的全长基因组cDNA克隆。测序结果表明,该弱毒株基因组序列全长为15 098 bp(不包括poly(A)尾)。同源性比较结果显示,Ningbo42株ORF7基因(EF473137)、FJ0603株Nsp2基因(EF592535)与该弱毒株的相应基因之间的同源性分别为100%和98%。这些数据暗示,国内欧洲型PRRSV Ningbo42株和FJ0603株的存在与欧洲型PRRSV弱毒疫苗株AMERVAC-PRRS/A3密切相关。测序及酶切鉴定结果表明,欧洲型PRRSV全长基因组cDNA克隆已构建成功。

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株和美洲株的理化特性及致病性比较

对分离自福建的3株美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)与2株欧洲型PRRSV进行了细胞致病性、动物致病性及理化特性的比较试验,结果显示PRRSV分离株均能在Marc-145细胞上增殖并产生细胞病变,但在PK-15、Vero、CEF、MDEF中盲传3代均不能产生细胞病变。理化性质试验表明美洲株与欧洲株PRRSV对酸、pH=3、氯仿、胰酶的敏感性一致;当pH=9时,PRRSV欧洲株比美洲株具有更强的抵抗力;不同的PRRSV毒株对温度的敏感性差异较大,同一型的病毒对温度的敏感性也不同。动物致病性试验结果表明欧洲型PRRSV-FJ0602株为弱毒株,对保育猪不具有致病性,而美洲型PRRSV-FJ0604株致病力强。

美洲型与欧洲型PRRSV双重RT-PCR检测方法的建立

【目的】为了建立一种具有高敏感性的能够区分猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型与欧洲型毒株的快速检测方法。【方法】从引物浓度与退火温度先对美洲型与欧洲型PRRSV的单项RT-PCR方法分别进行条件筛选与优化,之后对其双重RT-PCR方法进行条件筛选与优化,再进行特异性与敏感性试验和临床样品检测。【结果】建立的美洲型与欧洲型PRRSV双重RT-PCR检测方法不能检出猪瘟病毒与猪流行性腹泻病毒等当前流行较广的猪源RNA病毒,对美洲型与欧洲型PRRSV的检测灵敏度分别是66,40 copies/μL。此方法对2020年5个猪场的200份血清样品的检测结果显示,美洲型与欧洲型PRRSV的个体阳性率分别为44.0%和0,与单项RT-PCR方法检测结果完全一致。【结论】建立了一种高敏感性的美洲型与欧洲型PRRSV双重RT-PCR检测方法。

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。

广西猪繁殖与呼吸综合征病毒感染情况调查及其欧洲型毒株ORF5基因变异分析

为了解广西近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染情况及其欧洲型PRRSVORF5的遗传变异特点,2020年6月至2021年5月,采集广西14个设区市疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪病料、血清共782份,进行PRRSV的qRT-PCR分型检测及ORF5基因扩增,并运用SPSS23.0、DNAStar、MEGA X等生物学软件对检测结果及获得的PRRSVORF5基因序列进行分析。结果显示:样品检测总阳性率为29.54%,其中欧洲型(PRRSV-1)PRRSV阳性率为6.78%,美洲型(PRRSV-2)PRRSV阳性率为22.76%,表明受检猪群普遍存在PRRSV感染;在不同设区市中,贵港、崇左感染率最高(50.00%);在不同季度中,冬季感染率最高(41.00%);在不同年龄阶段猪群中,保育猪感染率最高(53.42%);感染主要以PRRSV-2为主,新发PRRSV-1感染;广西新发PRRSV-1在ORF5基因上存在相同独特的核苷酸及氨基酸变异特点,与中国香港分离欧洲株HKEU16亲缘关系较近,可能是在引种等贸易过程中所引进,并在饲养环境、免疫压力等多种因素的作用下发生了一定的变异;广西近期受检猪群普遍存在PRRSV-2感染,新出现PRRSV-1的感染,猪场应重视并及时调整、实施针对性的PRRS防控计划。

欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗的构建及免疫效果评价

目的构建欧洲型PRRSV重组腺病毒疫苗并对其免疫原性进行分析,为欧洲型PRRSV的感染预防提供依据。方法 PCR扩增欧洲型蓝耳病病毒ORF3、ORF5目的基因,将其连接到腺病毒穿梭载体,构建重组腺病毒穿梭质粒pacad-EU-ORF3、pacad-EU-ORF5、pacad-EU-ORF3-ORF5。将重组腺病毒穿梭质粒与骨架质粒共同转染至HEK 293细胞,构建重组腺病毒,并对构建的病毒用Western blot方法进行验证。用构建的重组腺病毒免疫BALB/c小鼠,通过淋巴细胞增殖试验对重组疫苗免疫效果进行初步评价。结果 Western blot显示重组腺病毒可稳定表达目的蛋白ORF3和ORF5,分子质量单位分别为30ku和22ku,与预期值相符。免疫小鼠淋巴细胞增殖试验显示重组腺病毒刺激指数均为PBS组1.5倍以上(P<0.05),且rAd-EU-ORF3-ORF5组显著高于rAd-EU-ORF3组和rAd-EU-ORF5组,表明重组腺病毒疫苗能够诱导机体淋巴细胞增殖,增强机体的细胞免疫应答水平。结论成功包装出重组腺病毒rAdEU-ORF3、rAd-EU-ORF5和rAd-EU-ORF3-ORF5,动物实验显示其具有良好的免疫原性。

对PRRSV快速分型的多重RT-PCR方法的建立与应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的Nsp2基因间的差异,设计3对特异性扩增引物,建立快速检测PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的多重RT-PCR方法。利用PRRSV欧洲株、经典株和高致病性Nsp2变异株及其他相关病毒株进行敏感度和特异性试验。结果显示,所建立的多重RT-PCR对欧洲株、美洲经典株与高致病性Nsp2变异株的RNA最小检出量分别为0.050 2、0.055 4、0.056 4ng,与CSFV、TGEV、JEV、SIV的核酸均无交叉反应。用该方法检测病料76份,结果PRRSV欧洲株、美洲经典株和高致病性Nsp2变异株的阳性率分别为0、7.89%和53.9%,未发现3型病毒间有混合感染的情况。检测结果与单一RT-PCR及RT-PCR检测试剂盒检测结果一致,高于病毒分离。

应用不同表达载体表达欧洲型PRRSV ORF5蛋白的研究

目的构建多种欧洲型PRRSV GP5蛋白原核表达载体,并比较其在大肠埃希菌中的表达效率。方法参考GenBank发表的欧洲型PRRSV LV株(GenBank登录号:M96262)ORF5序列,通过序列分析,设计合成ORF5全基因序列扩增引物及信号肽缺失引物。构建原核表达质粒pET-28a-GP5、pET-28a-gGP5、pET-22b-GP5、pET-22b-gGP5、pET-32a-GP5、pET-32a-gGP5、pGEX-4T-GP5、pGEX-4T-gGP5,经IPTG诱导后采用SDS-PAGE电泳分析GP5蛋白在各个原核表达载体的表达情况。结果 pET-28a-gGP5、pET-22b-gGP5、pET-32a-gGP5均没有高效的表达出缺失信号肽的GP5蛋白,缺少信号肽的GP5蛋白在pGEX-4T-1载体中高效表达,目的蛋白分子质量单位为42ku,与理论值相符。没有缺失信号肽的GP5蛋白在pET-28a-GP5、pET-22b-GP5、pET-32a-GP5、pGEX-4T-GP5,均未得到高效表达。结论本实验构建的重组原核表达载体pGEX-4T-gGP5能在大肠埃希菌中高效表达欧洲型PRRSV GP5蛋白,为进一步分析该蛋白的抗原性奠定了基础。

欧洲型PRRSV重组痘苗病毒候选疫苗猪体免疫效果研究

目的通过猪体免疫试验,评价欧洲型PRRSV重组痘苗病毒灭活疫苗的免疫效果。方法分别用重组痘苗病毒rVV-EU-ORF3-ORF5和灭活rVV-EU-ORF3-ORF5进行猪体免疫试验,通过检测猪血清特异性抗体中和抗体检测及T淋巴细胞增殖试验分析免疫效果。实验设E3L-VTT野毒免疫组和PBS组作对照。结果免疫后35d,欧洲型PRRSV重组痘苗病毒灭活疫苗免疫组和rVV-EU-ORF3-ORF5免疫组GP3、GP5特异抗体水平均达峰值（A值0.51~0.56）,两组间比较差异无统计学意义（tGP3=1.805,tGP5=0.7998,P〉0.05）,但均高于E3L-VTT野毒免疫组（A值0.33~0.43）,差异显著（tGP3=5.518,tGP5=3.346,P〈0.01）;猪血清中和抗体重组痘苗病毒灭活疫苗组与重组痘苗病毒疫苗组均与免疫后35d达峰值水平（分别为16.38和18.88）,且两组间比较差异无统计学意义（t=0.7005,P〉0.05）;T淋巴细胞增殖试验的SI值两疫苗组差异无统计学意义（t=0.2536,P〉0.05）,但均高于E3L-VTT野毒免疫组（t值分比为6.414和7.222,P〈0.01）。结论欧洲型PRRSV重组痘苗病毒灭活疫苗能诱导猪体产生体液和细胞免疫应答,可为欧洲型PRRSV的新型疫苗的研制提供参考。

美洲型与欧洲型PRRSV多重TaqMan荧光定量RT-PCR鉴别检测方法的建立及应用

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型经典毒株、高致病性变异毒株以及欧洲型毒株基因组的序列差异,设计2对特异性引物和3条TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株以及欧洲型毒株的多重荧光定量RT-PCR方法。该方法线性关系好,标准曲线的相关系数均达到0.999以上;特异性强,只有PRRSV出现阳性反应,而与口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型均无交叉反应;敏感性高,经典毒株、变异毒株、欧洲型毒株的检出下限分别为1.13、1.37、1.39copies/μL,均比普通RT-PCR敏感100倍;重复性好,组内及组间变异系数均小于1.5%。应用所建立的方法对采集的282份临床病料进行检测,结果 PRRSV阳性101份,其中95份为变异毒株、6份为经典毒株、4份为变异毒株和经典毒株混合感染,未检测到欧洲型毒株。结果表明,本研究建立的多重TaqMan荧光定量RT-PCR方法可为PRRSV的快速鉴别诊断及流行病学调查提供有效的技术手段。

欧洲型PRRSV辽宁株LNEU12的分离及其ORF5的序列分析

从辽宁某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病猪全血中分离到1株病毒,经Marc-145细胞5次传代后出现稳定的细胞病变(CPE),电镜观察病毒粒子直径约55 nm,并命名为LNEU12。采用RT-PCR方法扩增分离毒的ORF5全序列,再将目的基因克隆入p MD18-T载体进行测序,并与国内外已发表的毒株序列进行比较。结果表明:分离毒的ORF5基因与LV、Amervac株的核酸同源性分别为87.1%和87.6%,与国内分离的欧洲型毒株同源性为83.5%~94.2%。与LV株比较,分离毒GP5有22个氨基酸发生了变异,并存在3个潜在N-糖基化位点。基因系统发育树分析表明:分离毒LNEU12与BJEU06-1、NVDC-NM1-2011株的亲缘关系很近,而与VR2332美洲株处于不同的分支,由此推断分离毒LNEU12为欧洲型PRRSV。

猪繁殖与呼吸综合征病毒通用型实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)北美型毒株和欧洲型毒株N蛋白基因保守序列,设计1对特异性引物和1条探针,以ABI公司PRRSV RNA为标准品,优化了PRRSV实时荧光定量RT-PCR检测方法,25μL反应体系引物prrsv-f/prrsv-r(20μmol/L)各0.5μL,探针prrsv-p(10μmol/L)0.5μL为反应最佳工作浓度,标准曲线Ct值和模板启始浓度的log值之间具有良好的线性相关性。特异性、敏感性和重复性检测结果显示,该方法能特异的检测PRRSV北美型毒株和欧洲型毒株,与其他主要猪病病原检测无交叉反应;针对PRRSV RNA标准品检测,灵敏度可以达到10拷贝;重复性检测Ct值变异系数为0.74%～1.52%。用建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法,对40份临床样品检测,与商品化试剂盒检测结果完全一致。