太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)Cu/Zn SOD基因克隆及在重金属胁迫下的表达分析

铜锌超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)是一种广泛存在于生物体中最主要的抗氧化酶之一,在抵御过多活性氧簇对机体毒害的过程中起重要作用。本研究以太洋真宽水蚤为研究对象,采用RT-PCR与RACE方法克隆得到太平洋真宽水蚤Cu/Zn SOD基因全长c DNA序列。Cu/Zn SOD(Gen Bank登录号:MF289343)基因序列全长837bp,其中完全开放阅读框为456bp编码152个氨基酸,5′非编码区长297bp,3′非编码区长84bp,分子量约为15.050k Da,理论等电点为5.73。序列比较表明,太平洋真宽水蚤Cu/Zn SOD c DNA的氨基酸序列与其他甲壳动物的一致性较高;存在8个蛋白翻译后修饰位点及蛋白家族标签序列,无跨膜结构域与信号肽。在重金属铬与镍胁迫下,通过实时荧光定量PCR对太平洋真宽水蚤Cu/Zn SOD m RNA体内表达特点分析显示,其表达量均呈现先升后降趋势,在暴露12小时后表达量达到峰值;铬胁迫下的表达量略高于镍;联合胁迫下呈现出拮抗作用。本研究结果将有利于深入探讨桡足类Cu/Zn SOD基因的结构与功能,为进一步研究抗氧化分子机理奠定基础。

太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)CRH-BP基因克隆及表达分析

促肾上腺皮质激素释放激素结合蛋白(CRH-BP)是一种糖基化蛋白,与促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)具有很高的亲和力,对CRH诱导的脑垂体促肾上腺皮质激素(ACTH)的释放起到抑制作用。本研究采用RT-PCR与RACE基因克隆方法首次获得太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica)CRH-BP基因全长cDNA序列(GenBank登录号:MF289345)1950bp,其中ORF区1245bp编码415个氨基酸,5′非编码区841bp,3′非编码区294bp,理论分子量/等电点为45.816/5.87。生物学序列分析结果表明,太平洋真宽水蚤CRH-BP氨基酸序列与桡足类中近亲真宽水蚤同源性最高;具有6个蛋白修饰位点及蛋白家族标签序列,具有明显的跨膜结构域及信号肽。实时荧光定量PCR分析结果表明,太平洋真宽水蚤CRH-BP基因在盐度、温度及pH环境胁迫中的mRNA表达量均具有一定的时间梯度表达性与浓度梯度表达性特征。本文通过对太平洋真宽水蚤CRH-BP基因结构及不同环境因子刺激下的表达特点的研究为探究桡足类在环境应激、生殖生理及免疫调控等方面奠定了理论基础。

四溴联苯醚(BDE-47)对两种海洋桡足类动物的毒性效应

为了研究四溴联苯醚(BDE-47)对海洋桡足类的毒性效应,以太平洋真宽水蚤和日本虎斑猛水蚤为受试生物,依据急性毒性实验96 h-LC50值,设置5个浓度组和1个对照组,测定摄食率、滤水率、耗氧率、排氨率和抗氧化防御系统中SOD、GST、GPx活性以及GSH含量。结果显示:BDE-47对太平洋真宽水蚤和日本虎斑猛水蚤的96 h-LC50分别为57和851μg·L-1,后者明显高于前者。2种桡足类在BDE-47作用下,其能量摄入和代谢均受到不同程度的诱导或抑制。太平洋真宽水蚤在中浓度(1.425μg·L-1)下摄食率和排氨率受到促进,高浓度(5.70和11.40μg·L-1)下耗氧率明显抑制;日本虎斑猛水蚤高浓度下(170.20μg·L-1)摄食率受到抑制,中浓度(21.28μg·L-1)下耗氧率受到促进,各个浓度的BDE-47对其排氨率均有明显促进作用。太平洋真宽水蚤SOD活性在BDE-47暴露96 h过程中均低于对照组(P<0.05),受到明显抑制;GST活性随暴露时间延长先升高后降低;GSH含量和GPx活性低浓度(0.7125和1.425μg·L-1)下随时间先升高后降低,而高浓度(5.70和11.40μg·L-1)下则相反。日本虎斑猛水蚤SOD活性随BDE-47浓度的升高先降低后升高再降低;GST活性和GSH含量在低浓度(10.64和21.28μg·L-1)BDE-47中与对照组相比无显著差异(P>0.05),而高浓度(85.10和170.20μg·L-1)BDE-47下,GST活性随时间先升高后降低,GSH含量则先降低后升高再降低;GPx活性呈现先降低后升高趋势。由此可见,BDE-47与这2种桡足类的能量摄入、代谢和抗氧化防御系统存在一定时间及剂量效应,并具有明显的物种差异性。

指状许水蚤和太平洋真宽水蚤对UV-B辐射增强的敏感性比较

采用实验生态学的方法,以半数致死浓度LD50为依据,比较研究指状许水蚤(Schmackeria inopinus Burckhardt,1913)和太平洋真宽水蚤(Eurytemora pacifica Sato,1913)对UV-B辐射增强的敏感性差异。结果表明,3个发育阶段对UV-B辐射增强的敏感性由高到低依次排序为无节幼体>桡足幼体>成体。而雄体成体比雌性成体敏感。2种海洋桡足类比较,太平洋真宽水蚤和指状许水蚤对UV-B辐射增强的敏感性同样存有差异。在整个发育过程的各个时期,太平洋真宽水蚤的敏感性都明显高于指状许水蚤。纵观整个发育过程,太平洋真宽水蚤对UV-B辐射增强最敏感的时期是无节幼体NⅥ和桡足幼体CⅠ,而指状许水蚤对UV-B辐射增强最敏感性时期为无节幼体的NⅣ和NⅤ。

四溴双酚A对太平洋真宽水蚤的急性毒性及氧化胁迫

为了研究四溴双酚A(tetrabromobis-phenol A,TBBPA)对海洋桡足类的急性毒性和氧化胁迫效应,以太平洋真宽水蚤为受试生物,测定了TBBPA对其96 h急性毒性和对其体内抗氧化防御系统的影响。结果表明,TBBPA对太平洋真宽水蚤的96 h半数致死浓度(96 h-LC50)为178μg·L^(-1),95%可信区间为91~306μg·L^(-1),表现为极毒。亚致死浓度下,TBBPA能够不同程度影响太平洋真宽水蚤的抗氧化防御酶活力以及非酶物质含量。其中SOD和GST活性的变化趋势较为一致,暴露初期SOD和GST活性显著上升(P<0.05),随暴露时间延长酶活性有所下降,最终趋向对照组水平;GPx活性水平始终维持在对照组以上并且差异显著(P<0.05);暴露初期,GSH含量受轻微氧化压力而轻微升高,暴露48 h后GSH含量急剧下降并显著低于对照组(P<0.05)。太平洋真宽水蚤体内SOD、GST、GPx活性和GSH含量对TBBPA暴露均十分敏感,能够为海洋环境的TBBPA监测提供生化指标参考。

几种单胞藻对太平洋真宽水蚤生物学特性的影响

在静水实验条件下,研究了不同饵料种类和浓度对太平洋真宽水蚤存活率、产粪数和产卵量的影响。结果表明:在食物碳含量为1.0 mg C/L的条件下,不同饵料投喂后,太平洋真宽水蚤的存活率、产粪数和产卵量有明显的差异(P<0.05)。投喂亚心形扁藻、中肋骨条藻和三角褐指藻的存活率高于球等鞭金藻和小球藻(P<0.05);投喂中肋骨条藻的产粪数明显高于投喂其他4种单胞藻的产粪数(P<0.05);投喂亚心形扁藻和中肋骨条藻的产卵量明显高于小球藻(P<0.05),其他饵料种类的产卵量无显著差异(P>0.05)。实验进一步研究了不同浓度亚心形扁藻和中肋骨条藻对太平洋真宽水蚤生物学的影响,结果表明:不同浓度的亚心形扁藻对太平洋真宽水蚤的产卵量无显著影响(P>0.05);不同浓度的中肋骨条藻对太平洋真宽水蚤的存活率、产粪数和产卵量差异性显著,且随着浓度的升高其存活率、产粪数和产卵量逐渐减少(P<0.05)。投喂亚心形扁藻和中肋骨条藻饵料浓度为2.0 mg C/L时效果最好,表明此浓度条件下的亚心形扁藻和中肋骨条藻是太平洋真宽水蚤相对适宜的饵料,可为人工培养太平洋真宽水蚤作为水产活体生物饵料奠定基础。

太平洋真宽水蚤CYP4C和CYP44基因克隆及分子特征分析

采用RACE技术首次克隆太平洋真宽水蚤CYP4C和CYP44全长cDNA序列,并命名为EpCYP4C和EpCYP44。EpCYP4C基因全长序列2032 bp,5’非翻译区60 bp,3’非翻译区487 bp,开放阅读框1485 bp,编码494个氨基酸;EpCYP44全长cDNA序列1752 bp,开放阅读框1485 bp,编码494个氨基酸,5’非翻译区85 bp,3’非翻译区182 bp。经预测发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白具有CYP450家族蛋白特有的血红素结合区FxxGxxxCxG;而且EpCYP4C蛋白具有CYP4家族基因特征序列EVDTFMFEGHDTT。通过多序列比对和系统进化树分析发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白与近亲真宽水蚤同源性更高,亲缘关系更近。蛋白二级结构预测显示EpCYP4C和EpCYP44蛋白主要以α螺旋和无规则卷曲为主。亚细胞定位预测发现EpCYP4C和EpCYP44蛋白分布在细胞质和线粒体的可能性较大,这可能与CYP450酶系的解毒代谢机制相关。研究结果说明太平洋真宽水蚤EpCYP4C和EpCYP44基因均为CYP450酶系,且太平洋真宽水蚤EpCYP4C基因属于CYP4家族。对太平洋真宽水蚤EpCYP4C和EpCYP44基因的序列分析为进一步研究EpCYP4C和EpCYP44基因在污染物暴露下的表达奠定理论基础;同时有助于了解海洋桡足类CYP450超家族的分子特征。