ExoCET-BAC策略高效抓取和组装高AT含量基因组大片段

基因克隆是解析基因功能的重要手段,但仍有很多基因难以克隆,比如高AT含量(>60%)基因组来源的DNA。ExoCET克隆技术通过联合核酸外切酶介导的体外同源重组和大肠杆菌RecET重组酶介导的细胞内同源重组,不仅能从微生物基因组中靶向抓取>100 kb的大片段,而且能高效组装>13个DNA片段,是基因克隆的有力工具,迄今未有利用ExoCET技术从AT含量>63%的基因组克隆大片段的报道。本研究以AT含量为69%的海洋单细胞光合蓝细菌原绿球藻MIT 9301菌株的基因组为研究对象,探究了利用ExoCET技术进行高AT含量基因组大片段克隆的最佳条件。结果显示:①在核酸外切酶介导的体外同源重组时使用Gibson体系较T4聚合酶体系能获得更高的克隆效率;②载体应选择单拷贝的细菌人工染色体(BAC),多拷贝质粒载体会导致克隆失败;③ExoCET可以从原绿球藻基因组上抓取>80 kb的大片段,并且能以100%的正确率组装11个3 kb的DNA片段;④可以一步同时抓取4个7~20 kb的基因组大片段。大规模基因组测序显示高AT含量生物占比超过30%,该研究建立的ExoCET-BAC策略将为高AT含量生物的基因组功能研究提供高效使能技术。

染色体DNA琼脂糖包埋法辅助的ExoCET技术克隆放线菌天然产物生物合成基因簇

【目的】本研究旨在通过将琼脂糖包埋染色体DNA的方法与ExoCET重组技术相结合,建立放线菌天然产物生物合成基因簇的捕获方法。然后将克隆基因簇导入通用底盘宿主中,实现目标生物合成基因簇的异源表达。【方法】首先,利用低熔点琼脂糖包埋技术制备菌株的染色体基因组总DNA,再用限制性内切酶消化含有染色体DNA的琼脂块,获得线性化的DNA样品;然后利用ExoCET重组技术,以p15A线性载体片段将目标基因簇线性片段进行捕获;再通过PCR-targeting的方法向目标质粒中引入所需的接合转移DNA元件。接着,将改造质粒通过接合转移导入到Streptomyces coelicolor M1252宿主中,获得不同的重组菌株。最后,对不同的菌株进行发酵并提取化合物,最后进行活性检测以及质谱检测。【结果】通过该方法,从菌株S.lincolnensis NRR2936中成功获得了林可霉素生物合成基因簇(lmb-BGC),从菌株Nonomuraea nitratireducens WYY166^(T)中克隆得到了2个核糖体肽类化合物的生物合成基因簇(nioblantin,niob-BGC和nitblantin,nitb-BGC),并实现了lmb-BGC在天蓝色链霉菌M1252中的成功表达。【结论】本研究通过将低熔点琼脂糖包埋技术与ExoCET重组技术进行合理整合,定向克隆得到了林可霉素以及2个新颖的羊毛硫肽类化合物的生物合成基因簇。然后,分别对重组质粒改造后,在天蓝色链霉菌M1252宿主中进行表达,分别获得重组菌株MJX01、MJX02和MJX04。最后,利用质谱以及活性测试的手段对发酵提取物进行了检测,确定了林可霉素生物合成基因簇在天蓝色链霉菌M1252中成功表达。本研究为通过基因簇克隆和异源表达发掘新化合物奠定了基础。

基于紫外诱变与生物合成基因簇倍增的多氧霉素高产菌株构建

多氧霉素是一种抑制几丁质生物合成的广谱抗真菌类抗生素,对多种真菌引起的农作物病害具有显著的防治效果,且对人和动植物无害,是一种绿色安全的生物农药,目前仍然是全球应用最广泛的抗真菌农药之一。多氧霉素的主要作用机制在于竞争性抑制真菌细胞壁合成中几丁质合成酶的活性,因此对农作物真菌病害具有显著的防治效果。现代农业的发展对于绿色生物农药的需求日益增长,本研究的目的是构建多氧霉素关键活性成分——多氧霉素B的高产菌株。从一株自土壤环境中分离得到的金色链霉菌(Streptomyces ansochromogenes)出发,首先通过紫外诱变初步筛选多氧霉素B的高产突变菌株;然后利用ExoCET直接克隆技术对多氧霉素基因簇pol进行克隆,并在基因簇第1个基因上游分别添加原始启动子和kasOp*强启动子,通过整合酶phiC31将基因簇整合到突变株染色体上构建pol倍增菌株,HPLC-MS检测比较多氧霉素B的产量。通过紫外诱变育种和筛选获得了链霉菌突变株Pol-12菌株,其产量较野生型菌株提高了1.2倍。为进一步提高多氧霉素产量,利用ExoCET直接克隆技术将pol克隆至p15A载体,并通过接合转移转化Pol-12菌株获得pol倍增菌株S.ansochromogenes Pol-12::Pori-pol(M1)和S.ansochromogenes Pol-12::PkasOp*-pol(M2)。与受体菌Pol-12相比,菌株M1和M2多氧霉素B的产量分别提高了22倍和33倍。因此得出结论:紫外随机诱变育种联合基因工程定向育种可有效应用于多氧霉素高产菌株的构建,增加基因簇的拷贝数以及强启动子插入有效提高了多氧霉素B的产量。