孔雀石绿单克隆抗体的制备及直接竞争ELISA方法的建立

通过合成羧基化孔雀石绿,采用活泼酯法制备孔雀石绿免疫抗原CMG-BSA、检测抗原CMG-OVA。采用CMG-BSA免疫BALB/c小鼠,经融合、筛选和克隆化获得了一株稳定的抗孔雀石绿单克隆抗体,并建立了检测孔雀石绿的直接竞争ELISA方法。ELISA方法的最佳操作参数:孔雀石绿抗体稀释倍数1:16000(1mg/ml),酶标抗原(CMG-HRP)使用质量浓度0.2μg/ml。该方法具有良好的灵敏度和特异性,IC50值0.3ng/ml,最低检测灵敏度达到0.05ng/ml,标准曲线方程为y=-20.888x+81.423(R2=0.9813)。

高效液相色谱法直接拆分佐匹克隆对映体

目的:在反相条件下建立佐匹克隆对映体的简单、快速的拆分方法。方法:使用自制的未衍生β-环糊精手性固定相,以甲醇-水(或醋酸钠-醋酸缓冲液)为流动相,研究了流动相的组成、pH、柱温、流速对分离的影响,确定最佳色谱条件为流动相:甲醇-水(40:60),柱温为25℃,流速为0.2 mL·min-1,紫外检测波长为305 nm。结果:在所建立的色谱条件下,佐匹克隆对映体接近基线分离,探讨了拆分的机理,并与CHIRAL OD-H进口柱的拆分效果进行了比较。结论:所建立的方法直接、简便、快速。

副溶血性弧菌耐热直接相关溶血素基因的克隆与序列分析

目的探讨克隆副溶血弧菌(Vp)耐热直接相关溶血素基因的方法。方法用PCR技术扩增目的基因,双酶切载体pGEX-3X和目的基因DNA,连接并转化大肠杆菌DH5琢。对重组质粒进行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果凝胶电泳显示,标准株Vp14-91基因组DNA的PCR产物长约600 bp。阳性克隆的PCR产物也为一长约600 bp的条带,经双酶切可切出一约600 bp的条带。DNA测序结果表明与GenBank中的序列有99.1%的同源性。结论利用该方法成功克隆了目的基因,为制备用于现场检测的基因探针和Vp的保护性疫苗以及Vp的致病机制研究奠定了基础。

美味侧耳ITS序列直接测序与克隆测序比较分析

用CTAB法提取美味侧耳基因组DNA,利用引物ITS1和ITS4扩增其核糖体DNA的ITS片段,凝胶回收试剂盒纯化目的片段。通过PCR产物双向直接测序和克隆测序分别获得其rDNAITS序列,对两种测序方法所得序列及GenBank中美味侧耳ITS片段的序列进行比较分析。结果显示,三条序列的差异非常小,两种测序方法所得序列仅在两端出现差异,序列内部完全一致。

抗氯霉素单克隆抗体的制备及直接竞争ELISA方法的建立

用人工合成的氯霉素-卵清蛋白（CAP—OVA）免疫BALB／c小鼠，通过杂交瘤技术筛选出1株能稳定传代并分泌抗氯霉素（CAP）单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞4C9，并以此制备腹水单抗．经间接竞争ELISA（ciELISA）检测，该单抗亚类重链类型是IgG1，轻链为K类型，单抗腹水效价为1：1×10^6，与甲砜霉素、氟甲砜霉素以及其他常见抗生素的交叉反应率小于0．01％．用过碘酸钠氧化法合成CAP酶标记单抗，建立了CAP直接竞争ELISA（cdELISA）方法．此法检测的线性范围为0．1～100ng·mL^-1，半数抑制浓度（IC50）为5．81ng·L^-1添加回收实验表明所建立的CAPcdELISA方法检测限达到0．1ng·L^-1，对比试验表明其检测灵敏度与商品试剂CAP ELISA基本相当．

利用^(99m)Tc直接法标记单克隆抗体及其HPLC分析

比较了２－巯基乙醇（２－ＭＥ）、二硫苏糖醇（ＤＴＴ）和抗坏血酸（ＡＡ）做为抗体还原剂进行９９ｍＴｃ直接标记ＩｇＧ的结果．以ＤＴＴ做为抗体还原剂进行了９９ｍＴｃ标记单克隆抗体３Ｈ１１及其Ｆａｂ片段研究．建立了分析鉴定９９ｍＴｃ标记抗体的ＨＰＬＣ方法．采用ＴＳＫ４０００ＳＷ为色谱性（１３μｍ，７．５ｍｍ×３００ｍｍ）和０．１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．０）为流动相，同时进行紫外检测和放射性检测，可快速地同时测定样品的蛋白质含量和标记率．

副溶血弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆及原核表达

根据GenBank上已有的副溶血弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列,设计并人工合成引物。将耐热直接溶血毒素的基因全长克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1上,构建重组表达载体tdhA/pGEX-4T-1和tdhS/pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21(DE3),得到表达的工程菌株。优化诱导表达条件,表达耐热直接溶血毒素。转化有重组质粒tdhA/pGEX-4T-1,tdhS/pGEX-4T-1的BL21可稳定高效地表达可溶形式的目的蛋白。表达产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,用GST琼脂糖珠柱亲和层析纯化。溶血实验表明,表达的蛋白具有溶血活性。

麻痹性贝类毒素GTX2,3单克隆抗体在直接竞争ELISA检测方法中的应用

目的利用麻痹性贝类毒素GTX2,3单克隆抗体建立麻痹性贝类毒素GTX2,3直接竞争ELISA(dc-ELISA)检测方法。方法通过过氧化反应将GTX2,3与辣根过氧化物酶(HRP)偶联。以兔抗小鼠IgG多抗为包被抗体,GTX2,3为竞争剂,与GTX2,3-HRP竞争结合GTX2,3单克隆抗体,初步建立检测麻痹性贝类毒素GTX2,3的dc-ELISA,并用该方法检测GTX2,3单克隆抗体与C2毒素之间的交叉反应。结果直接ELISA检测证实GTX2,3与HRP偶联成功。dc-ELISA检测麻痹性贝类毒素GTX2,3的灵敏度为1.5μg/ml,工作范围为1.5～40μg/ml,GTX2,3毒素与C2毒素无交叉反应。该方法具有良好的特异性。结论dc-ELISA适用于麻痹性贝类毒素的快速检测。

副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆

目的探讨克隆副溶血性弧菌（Ｖｐ）耐热直接溶血毒素基因的方法。方法用ＰＣＲ技术扩增目的基因，双酶切载体 ｐＵＣ１９和目的基因 ＤＮＡ，连接并转化大肠杆菌 ＪＭ１０９。对重组质粒进行 ＰＣＲ鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果凝胶电 泳显示，标准株Ｖｐｌ４－９０基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ产物长约６００ ｂｐ。阳性克隆的ＰＣＲ产物也为一长约６００ ｂｐ）的条带，经双 酶切可切出一约 ６００ ｂｐ的条带。 ＤＮＡ 测序结果表明与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ中的序列有 ９９．６５％的同源性。结论利用该方法成功 克隆了目的基因，为制备用于现场检测的基因探针和Ｖｐ的保护性菌苗以及阐明Ｖｐ的致病机理奠定了基础。

反相高效液相色谱法直接拆分并测定佐匹克隆对映体

目的:建立一种用手性固定相拆分并测定佐匹克隆对映异构体的方法。方法:使用CHIRALCEL OD-R色谱柱(4.6mm×250 mm),乙腈-0.05 mol·L-1硫酸铵溶液(20:80)为流动相,流速0.8 mL·min-1在304 nm检测。结果:R-(-)和.S-(+)佐匹克隆峰的保留时间分别为10.6 min和12.0 min,分离度为1.8。结论:方法的重现性好,操作简单,可用于药品质量控制。

PCR产物直接测序还是克隆测序?——密叶杉属rDNAITS序列的测定方法

通过PCR产物直接测序和克隆测序对三种密叶杉属 (Athrotaxis)植物rDNA内转录间隔区 (ITS)及5 .8SrDNA序列进行了测定与分析。实验表明A .selaginoidesrDNA重复序列间的纯合程度很高 ,对PCR产物直接测序就可以测定其ITS区序列。而A .laxifolia、A .cupressoides的ITS1重复序列间的纯合程度较低 ,各重复单位间序列存在插入 /缺失 ,只有对PCR产物进行克隆测序才能确定其序列。A .laxi folia、A .cupressoides的ITS2区尽管也存在多态性 ,但不同重复序列的浓度比较平均 ,对PCR产物直接测序就可确定重复序列间的变异情况。本实验表明尽管是同一属的三种植物 ,但其rDNA重复序列间的纯合程度不同 ,同一植物ITS的不同区域 ,其重复序列间的纯合程度也不同 ,针对不同的ITS片段可采用不同的方法以测定其序列。

^(99m)Tc直接标记单克隆抗体3H11及其在小鼠体内分布的研究

以二硫苏糖醇（ＤＴＴ）为抗体还原剂，亚锡ＭＤＰ药盒为弱交换配体，进行了９９ｍＴｃ直接标记ＭｃＡｂ３Ｈ１１的研究．用ＨＰＬＣ分析鉴定标记物，标记率大于９５％，标记后不需纯化．体外竞争实验和在小鼠体内分布的研究表明，由标记得到的９９ｍＴｃ－３Ｈ１１和９９ｍＴｃ－ＩｇＧ，在体内和体外均是稳定的．

^（99m）Tc直接标记单克隆抗体片段的改进方法

采用改进法将９９ｍＴＣ直接标记了ＭＣＡＢＣＬ３Ｆ（ａｂ’）２，在０．１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ＝９．３的缓冲液中，标记率大于９５％．用荷ＬＳ１７４Ｔ瘤裸鼠作了显像和体内分布，在注射后１０ｈ可得清晰图像，该法可用于放射免疫显像。

一种直接克隆RT-PCR指纹图产物的方法

一种直接克隆ＲＴ－ＰＣＲ指纹图产物的方法最近报道了一种在反转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）基础上的敏感的指纹图方法，用以区分多基因家族成员中ｍＲＮＡ表达的不同。这种方法应用简并寡核苷酸引物进行ＲＴ－ＰＣＲ。其中一个引物５′端用３２Ｐ标记。引物识别基因家族中...

直接消化法分离单克隆贴壁细胞

目的 :建立一种高效的贴壁细胞单克隆分离法。方法 :将细胞悬液稀释成 4个密度梯度后接种于分隔开的血纤维蛋白膜层的皿上生长 ,克隆形成后吸 0 .2 5 %的胰酶消化 ,用移液器头直接挑取。结果 :永生细胞系和正常二倍体细胞在 10·cm- 2 ,5·cm- 2 两种接种密度时可分离到较多的单克隆 ,分离的单克隆永生细胞培养 1个月左右 ,细胞总数可达 10 6 个 ;但分离的正常二倍体细胞需培养 1个半月左右 ,细胞总数才达 10 6 个。结论 :细胞接种于被分隔成不同区域的血纤维蛋白膜层的皿上 ,采用直接消化法可有效获得单细胞克隆 ,接种密度以 10·cm- 2 ,5·cm- 2

直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性检测中的比较

目的：了解PCR产物直接测序法与克隆测序法在单核苷酸多态性（SNP）检测上的差别。方法：对2型糖尿病患者的载脂蛋白J外显子2基因及旁侧进行聚合酶链反应（PCR）扩增，分别对其产物进行直接测序和克隆测序。结果：在样本的检测中，PCR产物直接测序法所测序列与43～60bp以后克隆测序相同；检出一个突变位点并与GenBank（DQ012938）发表序列一致。结论：PCR产物直接测序法和克隆测序法都是检测SNP的有效方法，但前者不仅特异性强，敏感度高，而且比克隆测序方法更为快速简便，节省材料。

^(186)铼与抗结肠癌单克隆抗体的直接标记法及在荷瘤裸鼠体内的放射免疫显像

为探讨^(186)铼(^(186)Re)用于放射免疫显像的价值,用抗人结肠癌单克隆抗体(MAb)SC3A和以抗坏血酸为还原剂的直接标记法,对SnCl_2还原的^(186)Re标记物在荷结肠癌裸鼠体内的生物学分布及放射免疫显像进行研究。结果显示,本法的标记率均达96%～99%,标记物较稳定。在体与250倍以上的二乙烯三胺五乙酸(DTPA)和人血清白蛋白在37℃共育24h。未见标记物^(186)Re-SC3A解离。用过量肿瘤细胞抗原结合法测定。标记物抗体活性达90%～96%。48h活性下降〈10%。在注射^(186)Re-SC3A后24～48h肿瘤显像清晰,尤以48h为佳。这为^(186)Re用于临床放射免疫诊断提供了有关数据,并为其用于放射免疫治疗奠定了基础。

自制麻痹性贝毒GTX2，3单克隆抗体在直接竞争酶免疫学检测方法中的初步应用

【目的】建立麻痹性贝类毒素GTX2，3直接竞争酶免疫学检测方法（de-ELISA）。【方法】通过过氧化反应将GTX2，3与辣根过氧化物酶HRP偶联，利用适当稀释的兔抗小鼠IgG多抗作为包被抗体，利用GTX2，3作为竞争剂与GTX2，3-HRP竞争结合自制GTX2，3的单克隆抗体，初步建立检测麻痹性贝类毒素GTK2，3的de-ELISA，并用直接竞争ELISA检测该方法与C2毒素之间的交叉反应。【结果】直接ELISA结果显示GTX2，3与HRP发生过氧化反应，de-ELISA检测麻痹性贝类毒素时，该方法的灵敏度为1μg／mL，工作范围为1-40μg／mL，该方法与C2毒素无交叉反应。【结论】初步建立的dc-ELISA适用于麻痹性贝类毒素的快速检测，为其酶免疫学快速检测试剂盒的研制奠定了基础。

应用脾直接免疫法制备HCG单克隆抗体

应用脾直接免疫方法制备HCC单克隆抗体,获得了高效价BALB/c小鼠抗血清。稀释到1:150倍仍为强阳性(ELISA法)。采用上述方法用HCG免疫小鼠的脾细胞与NS-1细胞融合生成的杂交瘤细胞所分泌的抗体效价为1:6000以上(ELISA法)。脾直接免疫方法与传统免疫方法相比较,操作简便,免疫时间短,节省抗原。利用此方法获得分泌特异性抗体的杂交瘤与同一抗原,按传统方法免疫动物获得的杂交瘤所分泌的抗体,在效价上和抗体特异性上没有差别。是一种很实用的免疫方法。

^(99)Tc^(m)直接法标记单克隆抗体的研究Ⅱ.抗坏血酸在直接法标记过程中的作用

分析和比较了在^（９９）Ｔｃ~ｍ直接法标记单克隆抗体过程中，抗坏血酸在各个环节中的作用和影响。结果表明，在抗体还原完成后加入防氧化剂抗坏血酸可以防止还原后的—ＳＨ重新氧化，得到的标记产物在标记率和体外稳定性方面均优于不加抗坏血酸的标记法。该方法已成功地用于对Ｆ（ａｂ＇）＿２片段的标记并进行了荷瘤裸鼠体内分布和肿瘤显像测定，得到了很好的体外显像结果。