转单、双Bt基因741杨外源基因表达和抗虫性比较

【目的】研究联合使用两种或两种以上的抗虫基因的抗虫效果,同时鉴定并筛选出转双Bt基因741杨对鳞翅目和鞘翅目害虫有较强抗性的株系。【方法】选取转三基因(Cry3Aa+Cry1Ac+API)741杨8个株系、转双基因(Cry1Ac+API)741杨1个株系和转单基因(Cry3Aa)741杨3个株系为试材,从外源基因PCR检测、毒蛋白表达和抗虫性三方面对转基因株系进行对比分析。【结果】经PCR扩增后各转基因株系出现了预期的电泳条带。ELISA蛋白检测显示转基因株系中都有与所含基因相应的Bt杀虫蛋白表达。用转基因株系新鲜叶片进行柳蓝叶甲Plagiodera versicolora和美国白蛾Hyphantria cunea室内饲虫实验表明:转入不同抗虫基因的杨树对昆虫的抗性具有选择性,对非靶标昆虫没有毒杀作用。转双Bt基因741杨具有双抗性,不同转基因株系表现出高中低的抗性水平:在对柳蓝叶甲的抗性上,筛选出的其中5个高抗株系(pCCA1,pCCA2,pCCA5,pCCA6和pCCA9)的抗性水平明显比含Cry3Aa单Bt基因的3个高抗株系(pCC11,pCC53和pCC84)高;在对美国白蛾的抗性上,有7个株系(pCCA2～pCCA7和pCCA9)的抗性水平与含Cry1Ac单Bt基因株系(pB29)表现一致,只有1个株系(pCCA1)对美国白蛾表现出了极低的抗性。【结论】多个抗虫基因在741杨上的联合使用,不仅扩大了抗虫谱,其中的高抗株系还具有了更高的抗虫能力,有效地发挥了基因的叠加效应。

导入外源Bt基因与受体作物次生代谢物质的交互关系研究

转Bt基因作物是目前商品化进程最快的转基因作物之一,外源Bt基因的导入为培育有效控制有害生物的作物品种提供了新的手段,但外源基因的导入一定程度上改变了作物自身的基因序列,可能引起作物的代谢过程发生改变。本文对转Bt基因作物中导入的Bt基因所产生的杀虫蛋白与作物自身次生代谢物质含量及其效应的关系进行简要综述,结果表明基因的改造和重组已经影响到转Bt基因作物的一些代谢过程。

盐碱土壤转Bt基因棉花外源蛋白表达量时空变化及对抗虫性的影响

盐碱地是潜在的可利用耕地资源,但土壤盐碱化严重制约了农业生产的可持续发展。基于棉花机械化程度低、劳动力成本和生产资料投入剧增、比较效益下降和实施粮食生产安全战略等因素影响,我国长江流域和黄河流域棉花面积锐减,种植区域向内陆盐碱旱地或滨海盐碱地转移,但目前针对盐碱地转Bt基因棉种植可能带来的生态安全性问题研究甚少,正成为国内外研究的焦点和热点。伴随着棉花向盐碱地大面积转移种植趋势,检测盐胁迫是否影响转基因抗虫棉抗虫性,明确其影响程度,直接关系到转基因抗虫棉种植的安全性,也是目前抗虫棉扩大生产中迫切需要解决的问题。以非转基因棉花为对照,分别在低盐、中盐和高盐土壤种植的棉花的苗期、蕾期和花铃期采样,室内测定了转Bt基因棉花叶片对棉铃虫幼虫校正死亡率和外源蛋白表达量。研究结果发现盐分胁迫下转Bt基因棉花苗期叶片对棉铃虫幼虫校正死亡率下降了9.22%—47.46%,蕾期下降了31.61%—45.42%,花铃期下降了3.59%—18.52%;土壤盐分显著降低了转Bt基因棉花叶片中外源蛋白的表达量,苗期功能叶外源蛋白表达量下降了7.66%—29.86%;蕾期下降了3.77%—36.85%;花铃期下降了18.13%—41.02%;相关性分析表明,盐分胁迫条件下转Bt基因棉花叶片中外源蛋白表达量与其对棉铃虫抗性程度存在正相关关系。结果表明,盐碱土壤显著降低了转Bt基因棉花叶片外源杀虫蛋白表达量,从而导致转Bt基因棉花叶片对棉铃虫的抗虫性下降。研究土壤盐分对转Bt基因棉花对棉铃虫的影响及其作用机制,可为建立盐碱地转Bt基因棉花田害虫综合防控技术体系、转Bt基因棉花环境安全评价及转Bt基因棉安全管理提供依据。

2个抗虫棉的外源Bt基因分子鉴定及其染色体定位

以中美2个抗虫棉品种GK19与33B为试验材料,利用检测中美Bt基因的特异性引物,分别对抗虫棉亲本GK19和33B进行PCR扩增,并通过SSR分子标记技术对其Bt基因进行分子鉴定与染色体定位,旨在从外源基因转化事件的视角探究中美转基因抗虫棉差异的分子基础。结果表明,GK19为中国转Bt基因抗虫棉,33B为美国转Bt基因抗虫棉;GK19的Bt基因被定位在棉花Chr.20上,共16对SSR多态性标记与其Bt基因连锁,两侧的分子标记为NAU3907和NAU2579,其遗传距离分别为2.4 cM和1.5 cM;33B的Bt基因被定位在棉花Chr.26上,共20对SSR多态性标记与Bt基因连锁,目标Bt基因位于标记NAU460和dc40260之间,其遗传距离分别为3.6cM和2.0cM。以上结果表明GK19和33B属于不同的遗传转化事件。

转多基因欧美杨Bt基因表达特征

【目的】探究转多基因欧美杨107杨中外源Bt基因是否稳定存在及表达,探索转基因107杨不同时间、不同部位Bt毒蛋白表达规律,研究多基因转化的载体结构及基因互作对外源基因表达稳定性和高效性的影响。【方法】选取1年生转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨3个株系(A1、A2、A3)和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨3个株系(B1、B2、B3),通过PCR技术对转基因107杨中外源基因进行检测和验证,通过实时荧光定量PCR对Bt基因的转录丰度进行检测,利用ELISA技术对转基因107杨不同时间、不同部位毒蛋白含量进行检测。【结果】PCR检测结果显示,转基因107杨均能扩增出与阳性对照大小一致的特异性条带,阴性对照未扩增出特异性条带,证明外源基因在转基因107杨中稳定存在;实时荧光定量PCR检测结果表明,2种Bt基因在转基因107杨中均能稳定表达,Cry1Ac基因的转录丰度在2.1×10^4~5.1×10^4之间,Cry3A基因的转录丰度在2.8×10^6~5.6×10^7之间,Cry1Ac基因和Cry3A基因转录丰度无相关性;ELISA技术检测结果显示,转基因107杨中均检测到Cry1Ac和Cry3A毒蛋白存在。2种Bt基因转录丰度和毒蛋白含量无相关性,但2种Bt毒蛋白含量之间呈现出正相关关系。转2种不同载体的107杨6、7月份2种Bt毒蛋白的含量较低,8月份急剧上升,Cry1Ac毒蛋白的含量均在9月份达到峰值,Cry3A毒蛋白含量均在8月份达到峰值,10月急剧下降。8月份不同部位(上、中、下)的叶片Bt毒蛋白含量未表现出一致性规律,不同部位(上、中、下)木质部的Bt毒蛋白含量也未呈现出一致性规律。【结论】转Cry1Ac-Cry3A-NTHK1基因107杨和转Cry1Ac-Cry3A-BADH基因107杨不同株系间2种Bt基因的转录丰度存在显著差异,Cry3A基因的转录丰度显著高于Cry1Ac基因;2种Bt毒蛋白在各株系间存在显著差异,Cry1Ac毒蛋白含量极低,Cry3A毒蛋白含量极显著高于Cry1Ac,与转录水平检测结果一致。2种不同载体之间Cry1Ac基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量无明显差异,Cry3A基因转录丰度、毒蛋白表达模式及含量也无明显差异。在转基因107杨整个生长季中,Cry1Ac和Cry3A平均毒蛋白含量变化趋势基本一致,呈单峰模式。

外源甜菜碱对作物的抗旱作用效果研究

通过小麦浸种、水培、大面积喷施和茄子盆栽试验,研究了不同浓度外源甜菜碱对作物的抗旱作用效果。结果表明:外源甜菜碱浓度为25～50mg/L时可促进小麦种子发芽,光合作用强度[达7.07～7.57μmol/(s·m^2)]及生物学产量增加;在外源甜菜碱浓度100 mg/L时小麦幼苗叶片硝酸还原酶活性最高,达到35.23μg/(g·h),同时小麦抗旱性增强。数学模式寻优结果表明:在外源甜菜碱浓度26.4～68.9mg/L,土壤水分含量12.6％～20.7％时,可获得最佳的茄子生物总量。

外源甜菜碱对两种玉米耐盐性影响的研究

以玉米沈单和农大108为实验材料,研究了外源甜菜碱对盐分胁迫条件下玉米(Zeamay)幼苗水势、叶绿素含量、丙二醛(MDA)含量、细胞膜透性、cNa+/cK+等的影响.结果表明,外源甜菜碱能够提高玉米幼苗叶片水势、叶绿素含量,降低膜透性、丙二醛含量,参与多种代谢调节,影响作物的耐盐性.另外,外源甜菜碱可以增强根系对Na+,K+的选择吸收能力,促进质膜主动排Na+过程,降低盐胁迫下叶片中Na+含量.

外源甜菜碱对葡萄幼苗抗高温胁迫能力的影响

以1a生酿酒葡萄品种赤霞珠扦插苗为试材,研究了不同浓度的外源甜菜碱(GB)对提高葡萄幼苗抗热性的影响。结果表明,在高温胁迫下,叶面喷施不同浓度的GB均能显著降低葡萄幼苗叶片脯氨酸的含量和丙二醛(MDA)含量,维持较低的膜透性,提高葡萄幼苗叶片可溶性蛋白和抗坏血酸(AsA)含量,从而提高了葡萄幼苗的抗高温胁迫能力。证明GB对减轻高温胁迫引起的伤害,提高葡萄幼苗的抗热能力具有积极的作用。在所设4种GB浓度中以5.0mmol/L处理效果为佳。

外源甜菜碱对小麦幼苗抗旱性的影响

用不同浓度甜菜碱溶液对６个基因型小麦进行浸种和干旱后复水的试验，以幼苗反复干旱存活率高低作为幼苗抗旱性强弱的指标。结果表明，在第一次干旱后用５ｍｍｏｌ／Ｌ的甜菜碱溶液复水会明显提高小麦幼苗的相对含水量和抗旱性。基因型×处理的交互作用结果表明，不同基因型小麦对外源甜菜碱作用的反应有差异，用５ｍｍｏｌ／Ｌ和１５ｍｍｏｌ／Ｌ的甜菜碱溶液进行复水，会显著提高鲁麦１４幼苗的相对含水量和抗旱性。以较高浓度甜菜碱溶液（８０ｍｍｏｌ／Ｌ）浸种的小麦幼苗抗旱性差。

甜菜碱对干旱胁迫下棉花幼苗生理特性的影响

以新疆广泛种植的棉花品种新陆早18号为试材,通过测定棉花幼苗体内脯氨酸、可溶性糖和丙二醛(MDA)的含量及抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性,研究叶面喷施不同浓度甜菜碱(Glycine betaine,GB)对干旱胁迫下棉花幼苗生理特性的影响。结果表明,干旱胁迫下,与对照相比,脯氨酸、可溶性糖、MDA含量及SOD和POD活性都显著提高,喷施甜菜碱能促进脯氨酸和可溶性糖含量进一步提高,酶活性也显著升高,同时有效抑制了丙二醛含量的增加,CAT活性受干旱胁迫及甜菜碱的影响较小。研究表明喷施低浓度甜菜碱在一定程度上可以缓解干旱胁迫对棉花幼苗的伤害。

干旱胁迫条件下加工番茄对喷施甜菜碱的生理响应

以新疆广泛种植的加工番茄屯河8号为材料,通过盆栽和田间试验,测定了加工番茄叶片中叶绿素、可溶性蛋白、脯氨酸、可溶性糖和丙二醛含量以及抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)]活性和加工番茄产量,研究了干旱胁迫下加工番茄对叶面喷施不同浓度甜菜碱的生理响应。结果表明,干旱胁迫下喷施低浓度甜菜碱对加工番茄抵御干旱有一定的作用。干旱胁迫下喷施甜菜碱后,有效抑制了叶绿素和可溶性蛋白含量的下降,协同增加脯氨酸和可溶性糖的含量,抗氧化酶活性也显著增强,膜脂过氧化程度减弱即丙二醛含量下降,田间试验各生理指标的含量变化与盆栽结果相类似,干旱胁迫下喷施甜菜碱促进了加工番茄产量的增加。

外源甜菜碱提高恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)DLL-1耐盐性的研究

研究了外源甜菜碱对恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)DLL-1耐盐性的影响并对其渗透保护机制进行了初步的探讨;结果表明培养基中添加甜菜碱可以改善DLL-1细胞在高盐培养基中的生长情况,添加150mg/L的甜菜碱可以使DLL-1在1.2mol/L NaCl的基础盐培养基中生长,添加10mg/L的甜菜碱就足以显著缩短渗透胁迫条件下DLL-1细胞的延滞期和代时,增加生长量;和不添加对照相比,延滞期由24h缩短到6h,代时由60min缩短到35.7min,最大生长量OD610由1.29增长到1.57。在渗透胁迫条件下,细胞从外界快速吸收外源甜菜碱来代替自身相容性溶质的合成。

外源甜菜碱对冬小麦抗旱性生理指标的影响研究

在 3种不同土壤水分条件下 ,研究外源甜菜碱对返青—拔节期小麦叶片光合作用的影响 ,结果表明 :随着土壤水分下降 ,喷施 2 5～ 50 mg/kg外源甜菜碱对提高光合速率、胞间CO2 浓度、叶面积等生理指标越明显 ,有效地提高了小麦生物学产量。

外源甜菜碱对仁用杏抗旱生理指标的影响

对 2年生盆栽仁用杏嫁接苗喷施 10 0mg/L和 5 0 0mg/L甜菜碱 ,结果表明 ,在水分胁迫下 ,叶面喷施外源甜菜碱对胁迫过程中仁用杏叶片中脯氨酸和可溶性糖积累效果不显著 ,但可以不同程度的提高仁用杏叶片SOD活性 ,减少超氧阴离子的积累 ,减轻氧自由基对细胞质膜的伤害 ,并降低了MDA的含量 ,提高仁用杏的抗旱性。

水分胁迫下外源甜菜碱对桃叶片光合作用的影响

笔者研究了水分胁迫下叶面喷施甜菜碱对桃叶片光合作用的影响。结果表明,水分胁迫前期光合速率下降与气孔因素有关,后期光合速率下降与非气孔因素有关。对桃叶片喷施一定浓度的外源甜菜碱可以提高胁迫前期的净光合速率;这可能与甜菜碱处理提高SOD的活性,保持较低的超氧阴离子自由基生成速率和MDA含量,减轻干旱对树体伤害有关。

水分胁迫下外源甜菜碱对仁用杏叶片光合作用的影响

对2年生盆栽仁用杏嫁接苗喷施100mg/L和500mg/L甜菜碱,结果表明,在水分胁迫下,叶面喷施外源甜菜碱能维持仁用杏叶片较高的净光合速率,提高水分胁迫下仁用杏的光合能力,且叶面喷施低浓度的甜菜碱比高浓度的甜菜碱效果更明显。

外源物质处理下辣椒幼苗对低温胁迫的生理响应

【目的】研究外源物质处理对低温胁迫过程中辣椒幼苗生理生化的影响。【方法】用0.5 mmol/L外源亚精胺、50 mg/L壳聚糖、2 mmol/L水杨酸和10 mmol/L甜菜碱喷施处理辣椒幼苗,并将幼苗置于昼温/夜温为10℃/5℃条件下进行低温胁迫处理,分别在胁迫0、2、4、6和8 d,25℃/20℃恢复2 d后取样测定可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白、丙二醛含量和SOD、POD活性、叶绿素含量等生理指标,探讨外源物质对低温胁迫过程中辣椒幼苗生理活动的影响。【结果】适宜浓度的外源亚精胺、壳聚糖、水杨酸、甜菜碱处理能明显地降低低温胁迫过程中辣椒幼苗叶片中的MDA含量,增加可溶性糖、脯氨酸、可溶性蛋白含量和叶绿素含量,增强SOD和POD活性。【结论】4种外源物质均可不同程度地提高辣椒幼苗的抗冷性,作用效果最好的物质依次为亚精胺、壳聚糖、甜菜碱、水杨酸。

不同外源调节物质对低温胁迫下玉米的缓解效应分析

脯氨酸(Pro)和甜菜碱(GB)是一类重要的渗透调节物质,其与低温胁迫下植物的抗逆性密切相关。为了探讨不同浓度的外源Pro或GB对低温胁迫下玉米种子萌发、幼苗性状的影响,综合评价Pro或GB的低温缓解效果。本试验以3份寒敏感自交系为试材,分别在萌发期和苗期10℃低温胁迫下,用5种不同浓度的Pro或GB进行浸种、培养作为试验处理;25℃和10℃下以双蒸水浸种、培养作为正向、负向对照处理CK(+)、CK(-)。结果表明:(1)低温胁迫下,玉米种子的发芽势、发芽率、胚芽长、胚根长、胚芽鲜重和胚根鲜重显著降低;幼苗的相对电导率、丙二醛、脯氨酸及可溶性糖含量显著升高,SOD、POD及CAT活性显著增强。(2)添加外源Pro或GB后,除幼苗相对电导率和丙二醛含量明显降低外,其余5个幼苗性状和6个萌发性状都明显升高。(3)低温胁迫下,6个萌发性状和7个幼苗生理生化性状在自交系间差异显著,在Pro或GB浓度间差异显著,在自交系与浓度互作间差异显著。(4)利用低温缓解指数EI作为综合评价指标,并采用隶属函数法对外源Pro或GB的低温缓解效果进行综合评价表明,萌发期600、800μmol·L^(-1)Pro;20μmol·L^(-1)GB的综合低温缓解效果最佳,为0.882或0.647,1000μmol·L^(-1)Pro或50μmol·L^(-1)GB的综合缓解效果最小为0.513或0.022;苗期400μmol·L^(-1)Pro或10μmol·L^(-1)GB的综合低温缓解效果最佳为0.577或0.500,1000μmol·L^(-1)Pro或40μmol·L^(-1)GB的综合低温缓解效果最小仅为0.246或0.289;萌发期和苗期,外源Pro的综合低温缓解效果分别是GB的1.858倍和1.064倍。

SYBR~ Green Ⅰ实时PCR检测转Cry1Ab/c基因水稻

为了建立转基因产品新型检测技术,采用SYBR Green Ⅰ实时PCR技术和三对特异引物,检测抗虫转基因水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)。结果表明,利用SYBR Green Ⅰ染料能结合双链DNA的特点,应用实时PCR技术可检测到转Cry1Ab/c基因抗虫水稻外源基因(CaMV35S,NOS,Cry1Ab/c)扩增所产生的荧光信号,通过扩增产物的熔解曲线能有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体。SYBR Green Ⅰ实时PCR技术是转基因成分检测的一种新方法。

外源甜菜碱对低温胁迫下烟草幼苗生理特性的影响

【目的】探索外源甜菜碱对低温胁迫下烤烟幼苗生理特性的影响。【方法】以红花大金元和K326为材料进行盆栽试验,以在室温环境不施加外源甜菜碱条件下生长的烟草幼苗为正向对照(CK),以4℃低温胁迫下未施用外源甜菜碱溶液处理的烟草幼苗为负向对照(CK_0),设置5个外源甜菜碱浓度(0.012 5、0.050 0、0.100 0、0.150 0和0.200 0 mol/L)对4℃低温胁迫3 d的烟草幼苗进行灌根处理,对渗透物质含量、抗氧化酶活性、多酚代谢相关酶及总酚含量等指标进行测定。【结果】施用外源甜菜碱可对低温胁迫下烟草的一系列生理指标产生影响:可提高过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和多酚氧化酶(PPO)的活性;提高多酚含量以及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性;使可溶性糖和可溶性蛋白的积累增加;使丙二醛(MDA)和超氧阴离子(O_2~-)的含量以及电解质渗透率得到抑制。【结论】4℃低温胁迫下,红花大金元根施0.150 0 mol/L、K326施0.100 0 mol/L外源甜菜碱具有最大缓解效应。