非洲猪瘟病毒CD2v蛋白胞内域与胞外域的原核表达及其抗原性分析

【目的】应用大肠杆菌表达系统表达非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)CD2v蛋白胞外域(N-端,CD2v-N)与胞内域(C-端,CD2v-C)并分析两者的抗原性,为ASFV检测方法的研发提供试验依据和指导。【方法】构建CD2v-N和CD2v-C的重组原核表达质粒,在体外表达并纯化CD2v-N和CD2v-C蛋白,通过Western blotting对表达蛋白进行鉴定;用表达的CD2v-N和CD2v-C蛋白分别肌内接种免疫新西兰大白兔,共免疫3次,每次间隔2周;每次免疫后14 d,应用ELISA方法测定CD2v-N或CD2v-C的特异性抗体水平;用纯化后的CD2V-N和CD2v-C蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法检测95份ASFV感染猪的血清CD2v-N或CD2v-C特异性抗体,比较CD2v-N和CD2v-C在猪体内诱导的免疫反应水平。【结果】重组蛋白CD2v-N和CD2v-C分别以包涵体和可溶性形式表达,分子质量分别为22.9和34.0 ku,均能与猪抗ASFV血清特异性结合;用CD2v-N蛋白首免家兔后14 d,血清中未检测到特异性抗体,而在CD2v-C首免的家兔血清中检测到了高滴度的特异性抗体;三免后14 d,CD2v-N和CD2v-C蛋白免疫家兔的血清特异性抗体效价分别为1∶125000和1∶107;ELISA检测结果显示,ASFV感染猪的血清中CD2v-C特异性抗体水平显著高于CD2v-N(P<0.05)。【结论】本研究表达了ASFV CD2v蛋白胞内域和胞外域,前者的抗原性比后者高,CD2v胞内域作为ASFV免疫学检测技术研究与开发的靶标更具优势。该研究结果对ASFV检测方法的研究与开发具有重要指导意义。

小鼠抗寨卡病毒包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体的制备

目的制备小鼠抗寨卡病毒(ZIKV)包膜蛋白胞外区(Eecto)单克隆抗体。方法首先构建ZIKV Eecto的原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,将其转化至大肠杆菌感受态BL21后,利用异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。重组Eecto蛋白以包涵体形式表达,经过变性、复性和超滤获得纯化的蛋白。将Eecto蛋白3次免疫后,获得多克隆抗体血清,进行效价测定,并利用ZIKV prME真核表达质粒转染的HEK293T细胞进行Western blot法和免疫荧光法分析。取效价较高的小鼠脾脏制备脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,通过有限稀释法获取分泌抗体的杂交瘤细胞,并进一步制备腹水。对腹水进行抗体效价测定、亚类分析。以ZIKV同属病毒日本脑炎病毒(JEV)、黄热病病毒(YFV)、登革病毒1-4(DENV1-4)、蜱传脑炎病毒(TBEV)的Eecto为包被抗原,利用ELISA分析ZIKV单克隆抗体的交叉反应性,进一步对效价高、特异性强的抗体进行特异性分析。结果成功构建了原核表达质粒pET28a-ZIKV-Eecto,并获得纯化的Eecto蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性;制备筛选得到1D6、4F11、4H7、4F8四株单克隆抗体,其中三株(1D6、4H7、4F8)为IgGκ型抗体,一株(4F11)为IgMκ,1D6腹水效价大于1∶108;其中1D6和4H7为ZIKV特异性抗体,与其他黄病毒无交叉反应。结论成功制备了小鼠抗ZIKV Eecto单克隆抗体,为后续建立ZIKV检测方法及致病机制研究提供了实验材料。

中性粒细胞胞外诱捕网通过CCDC25促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的作用研究

目的探究中性粒细胞胞外捕获网(neutrophil extracellular traps,NETs)在骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭中的作用及其相关机制。方法纳入骨肉瘤患者和健康受试者各20例,通过ELISA检测血清中PAD4和H3cit水平。提取两组人群外周血中性粒细胞,比较NETs形成差异。将NETs与骨肉瘤细胞MG63共孵育,期间加入DNA降解酶DNaseⅠ,分为对照组、NETs组和NETs+DNaseⅠ组。通过蛋白质印迹检测CCDC25蛋白表达水平,CCK8检测细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移和侵袭水平。将si-NC和si-CCDC25转染至MG63,加入NETs共孵育,分为si-NC组和si-CCDC25组,通过蛋白质印迹检测CCDC25蛋白表达水平,CCK8检测细胞增殖水平,Transwell检测细胞迁移和侵袭水平。结果与健康受试者比较,骨肉瘤患者血清中PAD4和H3cit水平升高(P<0.05),NETs形成能力增强。与对照组比较,NETs组CCDC25蛋白表达升高,细胞增殖、迁移和侵袭水平升高(P<0.05)。与NETs组比较,NETs+DNaseⅠ组CCDC25蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05)。与si-NC组比较,si-CCDC25组CCDC25蛋白表达降低,细胞增殖、迁移和侵袭水平降低(P<0.05)。结论NETs通过释放的DNA激活骨肉瘤细胞CCDC25表达,从而促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

异钩藤碱对大鼠急性胰腺炎细胞的炎症和凋亡改善及ERK信号通路调控作用

目的观察异钩藤碱(LSO)对大鼠急性胰腺炎(AP)细胞炎症和凋亡改善及ERK信号通路调控作用。方法将AR42J细胞分为6组,对照组正常培养,模型组、LSO组、抑制剂组、LSO+抑制剂组、LSO+激活剂组加入100 nmol/L雨蛙素制备AP细胞模型,LSO组制模后加入40μmol/L LSO,抑制剂组制模后加入10μmol/L U0126,LSO+抑制剂组制模后加入40μmol/L LSO和10μmol/L U0126,LSO+激活剂组制模后加入40μmol/L LSO和0.1μmol/L C16-PAF。采用ELISA法、EdU法及Hoechst 33258染色法分别测定细胞培养液中的炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β)、细胞增殖率和凋亡率,qPCR法测定细胞中NLRP3、斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)mRNA,WB法测定细胞中ERK 1/2、p-ERK 1/2、NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白。结果与对照组比较,模型组细胞TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、凋亡率、p-ERK 1/2蛋白及NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA和蛋白升高,增殖率降低(P均<0.05);与模型组比较,LSO组、抑制剂组细胞炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β)、凋亡率、p-ERK 1/2蛋白及NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA和蛋白降低,增殖率升高(P均<0.05);与LSO组比较,LSO+抑制剂组中U0126增强了LSO对细胞上述指标趋势的作用,而LSO+激活剂组中C16-PAF则逆转了LSO对细胞上述指标趋势的作用(P均<0.05)。结论LSO对大鼠急性胰腺炎细胞的炎症和凋亡有改善作用,可能通过调控ERK信号通路来实现。

黄芪多糖在Her-2阳性乳腺癌患者化疗中增效减毒的作用及其对血清Her-2-ECD、TAP和疗效的影响

目的:探讨黄芪多糖在人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,Her-2)阳性乳腺癌患者化疗中增效减毒的作用及其对血清人表皮生长因子受体-2胞外段(human epidermal growth factor receptor-2-extracellular domain,Her-2-ECD)、肿瘤异常糖链糖蛋白(tumor abnormal protein,TAP)和疗效的影响。方法:选择2020年1月—2023年6月新余北湖医院收治的90例Her-2阳性乳腺癌患者作为研究对象,将患者随机分为对照组和观察组,各45例。两组均给予TCbHP(多西他赛+卡铂+曲妥珠单抗+帕妥珠单抗)方案治疗;观察组在此基础上给予注射用黄芪多糖治疗。比较两组治疗前后的中医症候积分、血清Her-2-ECD、TAP水平、免疫功能(CD4^(+)、CD8^(+))、白细胞(white blood cell,WBC)水平、乳腺癌患者的生活质量量表(functional assessment of cancer therapy-breast,FACT-B)评分、疗效及不良反应发生率。结果:治疗前,两组各项中医症候积分、Her-2-ECD、TAP、CD4^(+)、CD8^(+)、WBC、FACT-B评分比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后,观察组各项中医症候评分、Her-2-ECD、TAP、CD8^(+)、FACT-B各项评分及不良反应发生率均低于对照组,CD4^(+)、WBC、总有效率均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:黄芪多糖能够改善Her-2阳性乳腺癌化疗患者的化疗效果,减轻化疗带来的毒性反应,提高患者的生活质量。

脓毒症患者血清NLRC3、ECM1表达与急性呼吸窘迫综合征的相关性研究

目的探讨脓毒症患者血清NOD样受体家族含CARD结构域蛋白3(NLRC3)、细胞外基质蛋白1(ECM1)表达与急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的相关性。方法选取脓毒症患者133例纳入脓毒症组,并选取同时间段体检健康者80例纳入对照组。根据是否并发ARDS分为ARDS组(52例)和非ARDS组(81例),采用酶联免疫吸附法检测血清NLRC3、ECM1表达。通过多因素Logistic回归分析筛选脓毒症患者并发ARDS的因素。采用受试者工作特征(ROC)曲线分析血清NLRC3、ECM1表达对脓毒症患者并发ARDS的预测价值。结果与对照组比较,脓毒症组血清NLRC3表达降低,ECM1表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。133例脓毒症患者ARDS发生率为39.10%(52/133)。与非ARDS组比较,ARDS组血清NLRC3表达降低,ECM1表达升高,差异有统计学意义(P<0.05)。脓毒症患者并发ARDS的独立危险因素为序贯器官衰竭评估评分增加、血乳酸升高、ECM1升高,独立保护因素为NLRC3升高(P<0.05)。血清NLRC3、ECM1表达联合预测脓毒症患者并发ARDS的曲线下面积为0.887,大于血清NLRC3、ECM1表达单独预测的0.811、0.792(P<0.05)。结论脓毒症患者血清NLRC3表达降低和ECM1表达升高与并发ARDS密切相关。血清NLRC3、ECM1表达联用对脓毒症患者并发ARDS有较高的预测价值。

人DC-SIGN全长编码区基因的克隆及其胞外段的原核表达

目的:克隆人DC-SIGN全长编码区基因,获得其胞外段的原核表达产物。方法:采用RT-PCR方法,从健康产妇胎盘中克隆DC-SIGN全长cDNA,扩增其胞外段基因并构建pET41a-sDC-SIGN重组表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,以SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。结果:从健康产妇胎盘总RNA中,扩增获得约1300bp的DNA片段,克隆至pGM-T载体获得重组质粒pGM-DC-SIGN。从pGM-DC-SIGN扩增DC-SIGN的胞外段基因,构建重组表达质粒pET-41a-sDC-SIGN;纯化表达产物sDC-SIGN-GST,鉴定其相对分子质量(Mr)为66000,Western blot证明其可与抗DC-SIGN抗体特异性结合。结论:成功克隆DC-SIGN全长编码区基因,并在大肠杆菌中成功表达其胞外段融合蛋白sDC-SIGN-GST,为进一步研究DC-SIGN的功能奠定了基础。

人Toll-like receptor 2胞外段的克隆和表达

目的 克隆、表达人Toll-like receptor2(TLR2)胞外段(A26-T588)基因,获得人TLR2胞外段蛋白。方法 RT-PCR扩增TLR2胞外段基因,以pcDNA3.1+质粒为载体在HEK293细胞中表达TLR2胞外段蛋白,同时以pcDNA3.1+/TLR2(A26-T588)重组质粒免疫昆明鼠,制备抗TLR2胞外段蛋白多抗。结果 PCR扩增及重组质粒测序结果表明成功地构建了pcDNA3.1+/TLR2(A26-T588)真核表达质粒,SDS-PAGE分析纯化产物在M_r为68000处出现明显蛋白条带。重组质粒DNA免疫小鼠3次后,血清抗体滴度可达1∶250。TLR2胞外段蛋白可与LPS结合,并在一定的质量浓度范围内呈剂量依赖性。结论 构建的pcDNA3.1+/TLR2(A26-T588)真核表达质粒可在哺乳动物细胞中表达TLR2胞外段蛋白,并与重组质粒DNA免疫小鼠抗血清及TLR2单克隆抗体TL2.1特异性反应,由此证明其表达正确。

CD44H胞外区cDNA片段的克隆及在大肠杆菌中的表达

以ｐＵＣ／ＣＤ４４为模板，用ＰＣＲ法扩增出Ｈ型ＣＤ４４的ｃＤＮＡ片段。用ＥｃｏＲＩ／ＢｃｌＩＩ双酶切保留编码ＣＤ４４Ｈ的信号肽及胞外区ＤＮＡ片段，插入融合蛋白表达载体ＰＥｘ３１ｂ的ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ位点，形成重组质粒ＰＥＸ－ＣＤ４４，将ＰＥＸ－ＣＤ４４导入大肠杆茵ＲＲ１（ＰＣＩ８５７），经４２℃温控诱导，有额外蛋白的产生，分子量与预期大小一致，表达产物形成包涵体，表达产量占菌体总蛋白的２１％左右。提取包涵体，经初步纯化纯度达８５％左右。ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ证实重组蛋白能被抗ＣＤ４４的单克隆抗体特异识别。

proBDNF对培养的海马神经元存活的影响及其机制

目的:初步探讨proBDNF(precursor of brain-derived neurotrophic factor)对海马神经元的可能作用及其机制。方法:采用体外培养胚鼠海马神经元,并给予proBDNF,preBDNF(propeptide of proBDNF)和抗proBDNF血清处理;30min,1h和48h后行尼氏染色,ELK-p(Ets domain protein),ErK2(extracellularsignal regulated kinase)和c-fos免疫细胞化学染色。结果:给予proBDNF处理后,可见培养细胞内ELK-p,ErK2和c-fos表达明显上调,部分细胞核深染;而用抗血清中和内源性proBDNF后,ELK-p、ErK2和c-fos均下调,且细胞出现肿胀、空泡样变化。preBDNF处理组细胞与正常对照组类似。结论:proBDNF可维持海马神经元的存活,其机制可能与激活ErK和ELK信号通路有关。

人表皮生长因子受体结构域蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的:构建人表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ED)和胞内激酶结构域(PKD)的原核表达载体,获得纯化的GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增EGFR的ED和PKD基因编码序列,将其正确插入p GEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose4B珠子纯化融合蛋白。结果:构建得到GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,经Western印迹检测,融合蛋白成功表达;纯化得到融合蛋白GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD。结论:克隆了GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD基因,并获得了活性良好的GST-EGFR-ED和GST-EGF-PKD融合蛋白,为研究EGFR在肿瘤中的作用奠定了实验基础。

血清HER2 ECD+VEGF+HE4对乳腺癌术后复发转移的诊断价值

目的比较血清人类表皮生长因子受体2胞外片段(HER2 ECD)、人附睾蛋白4(HE4)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)和HER2 ECD+VEGF+HE4在乳腺癌术后复发转移中的诊断价值,以期选择最佳的检测方法,提高检测乳腺癌术后复发转移的灵敏度。方法选取接受手术治疗的86例乳腺癌患者作为研究对象,其中,术后复发转移患者34例(复发组),术后未复发转移患者52例(未复发组);另选取同期体检的40例健康女性作为对照组。检测3组受试者的血清HER2 ECD、VEGF、HE4水平。以病理学诊断结果作为金标准,分析不同检测方法对乳腺癌术后复发转移的的诊断效能。结果复发组患者的血清HER2 ECD、VEGF、HE4水平均高于未复发组和对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05);未复发组患者的血清VEGF、HE4水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.05)。血清HER2 ECD+VEGF+HE4联合检测乳腺癌术后复发转移的灵敏度为88.24%(30/34),特异度为86.54%(45/52),漏诊率为11.76%(4/34),误诊率为13.46%(7/52)。结论血清HER2 ECD+VEGF+HE4联合检测较三者单独检测能够提高对乳腺癌术后复发转移诊断的灵敏度,具有较高的临床诊断价值。

H9N2亚型禽流感病毒M2e蛋白在原核系统中的表达

以含有全长H9N2亚型AIV M2基因的质粒为模板,经PCR扩增得到M2e基因;利用BglⅡ和BamHⅠ之间互为同尾酶关系,构建顺次连接的多拷贝体M2e,并连接入原核表达载体pGEX-6p-1,构成2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组质粒,并转化至表达宿主菌中;将测序正确的菌液经不同浓度IPTG进行诱导,SDS-PAGE电泳鉴定重组蛋白大小,对蛋白进行可溶性分析;利用Western blot分析5种重组蛋白的反应原性。结果显示,在37℃下,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白分别经终浓度为0.25、0.25、0.5、0.25、0.75mmol/L的IPTG诱导4h时,表达量最高;2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2e-pGEX重组蛋白大小分别为31.7、37.2、42.7、48.2、53.9ku;对重组蛋白进行可溶性分析显示,5种重组蛋白均以包涵体形式存在;Western blot分析显示,2M2e-pGEX、4M2e-pGEX、6M2e-pGEX、8M2e-pGEX和10M2epGEX重组蛋白与鼠抗GST标签的单克隆抗体具有良好的特异性反应,为后期进一步获得高免疫原性蛋白和筛选具有通用免疫原性的重组蛋白奠定基础。

人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定

目的构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定。方法应用PCR方法扩增EGFRvⅢ ECD片段,将其T-A克隆和测序,再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达。采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中。SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-vⅢECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上。Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别。结论成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究。

犬CTLA-4胞外区的分子克隆、表达和对犬细小病毒VP2的免疫佐剂作用

【目的】探索犬细胞毒性T细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4)胞外区作为免疫佐剂的可行性。【方法】根据已发表序列设计引物,用RT-PCR扩增CTLA-4胞外区编码序列,用PCR扩增犬细小病毒(canine parvovirus,CPV)VP2蛋白主要抗原表位基因片段VP2S,将VP2S克隆入含和不含CTLA-4胞外区基因片段的原核表达质粒pQE-31;用获得的重组质粒pQE-CTLA-4-VP2S和pQE-VP2S转化大肠杆菌,并进行诱导表达;用相同剂量的重组蛋白VP2S和CTLA-4-VP2S免疫小鼠,用间接ELISA和血凝抑制试验比较两个免疫组的抗体水平。【结果】经过30次循环PCR扩增后,琼脂糖凝胶电泳显示预期大小的扩增产物;序列测定结果显示,克隆的毕格犬CTLA-4胞外区与已发表序列的核苷酸同源性为99.2%,氨基酸序列同源性为98.4%,结合B7分子的六肽基序(MYPPPY)无变化;VP2S与已发表CPV VP2的核苷酸序列同源性为99%,氨基酸序列同源性为98.6%;经IPTG诱导后,两种重组大肠杆菌表达预期的29kDa VP2S和42kDa CTLA-4-VP2S重组蛋白,两者均能被CPV抗血清识别;间接ELISA和血凝抑制试验结果显示,CTLA-4-VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第2周,抗体高峰期为初免后第4周,而VP2S免疫组的抗体产生时间为初免后第4周,抗体高峰期为初免后第5周,两个试验组高峰期ELISA抗体效价和血凝抑制抗体效价分别相差100倍和10倍。【结论】犬CTLA-4胞外区可作为分子佐剂促进CPV VP2蛋白抗体的产生。

人促甲状腺素受体膜外区蛋白在原核系统表达及其生物活性鉴定

为研究重组人促甲状腺素受体 (hTSHR)膜外区表达产物及其生物活性与免疫活性 ,将hT SHR膜外区编码基因 (编码第 3～ 4 2 0位氨基酸 )重组到表达型质粒pGEX 4T 3上 ,测序结果表明序列正确 ,未改变读码框架 .然后转入E .coliAd4 94进行诱导表达 .纯化后的表达产物经SDS PAGE、Western印迹及放射受体法分别检测其分子量、免疫活性和生物活性 .重组TSHR3～ 4 2 0 膜外区蛋白 (简称TSHR3～ 4 2 0 )产率为 15 9～ 2 0 2 μg L培养基 ,分子量为 4 8.9kD ;融合蛋白 (简称GST TSHR3～ 4 2 0 )分子量为 75 .4kD .两种表达产物都可与TSHRAb反应 ;TSHR3～ 4 2 0 可与12 5I TSH结合 .

WWOX与ERK1在食管鳞状细胞癌中表达及其临床病理意义

目的:检测食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中含WW结构域的氧化还原酶(WW domain-containing oxidoreductase,WWOX)蛋白和细胞外信号调节蛋白激酶1(extracellular signal regulated protein kinase 1,ERK1)表达及其与ESCC病人临床病理参数的相关性。方法:采用免疫组织化学EliVisionTM plus法检测150例ESCC和80例正常食管黏膜组织(对照组)中WWOX和ERK1蛋白的表达情况。结果:ESCC组织中WWOX和ERK1蛋白的阳性表达率分别为46.0%和58.7%;对照组中WWOX和ERK1蛋白的阳性率分别为85.0%和42.5%,差异均有统计学意义(P<0.05)。ESCC组织中WWOX蛋白阳性率与ERK1蛋白阳性率呈负相关关系(P<0.01)。WWOX和ERK1蛋白阳性表达率在ESCC病人不同肿瘤组织浸润深度、TNM分期和是否淋巴结转移间差异均有统计学意义(P<0.05~P<0.01)。生存分析显示,WWOX蛋白阳性表达病人的生存时间高于阴性者(P<0.05)。多因素回归分析显示,WWOX和ERK1蛋白阳性表达及TNM分期是影响ESCC病人术后生存的独立影响因子(P<0.05~P<0.01)。结论:WWOX和ERK1的异常表达参与了ESCC的发生、发展、浸润以及转移,早期联合检测WWOX和ERK1蛋白表达对ESCC的进展和预后判断有重要意义。

盘状结构域受体1抑制剂对癌症和炎症相关疾病治疗作用的研究进展

盘状结构域受体(DDR)是跨膜受体酪氨酸激酶(RTK)超家族的成员,DDR与RTK的区别在于细胞外结构域中存在盘状蛋白基序,并且可以利用胶原蛋白作为内部配体。目前已鉴定出2种类型的DDR,即DDR1和DDR2,二者具有不同的表达谱和配体特异性。这些DDR在细胞增殖、存活、分化、黏附和基质重塑过程中起着重要作用。DDR与各种癌症、纤维化疾病和动脉粥样硬化等疾病密切相关。DDR1可促进胶原纤维排列,引发免疫排斥。在小鼠模型中,使用DDR1细胞外结构域单克隆抗体、消融DDR1细胞外结构域均可促进肿瘤内T淋巴细胞的渗透,并抑制肿瘤的生长。因此,DDR1被认为是肿瘤新的潜在免疫治疗靶标。本文对DDR1抑制剂对癌症和炎症相关疾病治疗作用的研究进展进行综述。

人胰岛素样生长因子1受体β结构域蛋白的原核表达及活性检测

目的构建人胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)β亚基胞外结构域(ED)和胞内激酶(PKD)结构域的原核表达载体,获得纯化的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法用PCR方法从乳腺cDNA文库中扩增IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因编码序列,将其正确插入pGEX-KG载体。重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose 4B珠子纯化融合蛋白,并用Western blot法检测融合蛋白表达,最后用GST pull-down技术检测纯化蛋白与已知蛋白表皮生长因子受体2驱动的细胞运动调节蛋白(MEMO)的相互作用。结果构建得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,测序后与目的序列一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,并经过Western blot检测,融合蛋白成功表达;纯化得到GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD两个融合蛋白,GST pull-down证明蛋白GST-IGF1Rβ-PKD可以和MEMO相互作用。结论成功克隆GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD基因,并获得活性良好的GST-IGF1Rβ-ED和GST-IGF1Rβ-PKD蛋白。

富含二硫键的膜蛋白p185胞外区在大肠杆菌中的可溶性表达和性质鉴定

Her2/c_erbB_2基因(其产物为膜蛋白p185)是表皮生长因子受体(EGFR)基因家族的一员,在约30%的乳腺癌中发现了其过量表达。为了鉴定抗p185单克隆抗体的抗原表位并进一步研究它们的相互作用,采用PCR的方法从含Her2/c_erbB_2基因的pBabe/erbB_2质粒中扩增了p185胞外区的富含二硫键的第一、二结构域和第四个结构域。产物克隆到pGEX/4T_1载体后,转化大肠杆菌OrigamiB(DE3)pLysS菌株,用低浓度IPTG进行低温过夜诱导后将菌体压力破碎,SDS_PAGE检测表达上清,得到了可溶性表达的融合有GST的目的蛋白。经ELISA、Westernblot等方法鉴定,可溶性表达产物具有完全的抗体结合活性,且当用凝血酶把GST切掉后该活性仍然保留。p185胞外区融合蛋白的成功表达将为二硫键富含类蛋白的表达提供参考;并为将来具有肿瘤细胞生长抑制活性的抗p185单克隆抗体的抗原表位鉴定,以及为EGFR家族受体的结构和功能关系的研究打下基础。