猪链球菌2型MRP与EPF基因串联表达蛋白及其免疫保护作用

根据猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)和胞外蛋白因子(extracellular protein factor,EPF)的基因序列,各设计合成一对引物,以猪链球菌2型江苏分离株SS2-1的基因组为模板,扩增mrp基因1 801~2 513位序列和epf 基因1 783~2 563位序列,分别构建原核表达载体pET32a-mrp 、pET32a-epf,确定诱导表达的两种蛋白都具有免疫原性后,提取阳性克隆质粒各自进行双酶切并纯化,通过PCR串联两片段,将目的片段定向克隆到表达载体pET-32a中,重组质粒转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达分子量约为74kD的融合蛋白.用制备的两种抗血清与纯化融合蛋白进行免疫转印,结果显示融合蛋白分别具有MRP与EPF的中和表位.用融合蛋白MRP-EPF免疫新西兰兔,以最小致死量猪链球菌强毒株SS2-1攻击,兔的存活率达50%(2/4),存活率明显高于单个表达产物.证实串联表达的融合蛋白为重要的保护性抗原.

猪链球菌2型国内分离株毒力相关蛋白的分析

提纯猪链球菌 2型江苏分离株HA980 1的毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白 (muramini dase releasedprotein ,MRP)和胞外因子 (extracellularfacter,EF) ,制备其抗体供免疫转印之用。另提取猪源链球菌 1 7株国内分离株、1株德国分离株及 1株猪链球菌 2型人分离株的胞壁和胞外蛋白 ,经SDS PAGE ,与HA980 1株的MRP和EF的抗体作免疫转印。 1 1株MRP阳性 ,1 0株EF及EF 阳性 ,MRP及EF的分布存在 4种表型 :MPR+ EF+ (8 1 9) ,MRP+ EF (1 1 9) ,MRP+ EF- (1 1 9) ,MRP- EF- (1 0 1 9)。

猪链球菌2型毒力因子部分片段的克隆与表达

根据猪链球菌2型(Streptococcussuistype2)胞外蛋白因子(extracellularfactorprotein,EF)的基因(epf)序列,设计合成一对引物,以猪链球菌2型江苏分离株SS2-H的基因组为模板,扩增epf基因1585-2547位序列,进行T/A克隆,转化入宿主菌DH5α中。提取阳性克隆质粒进行双酶切并纯化,将目的片段向克隆到表达载体pET-32a中组氨酸的下游,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导可表达分子量约为53000的融合蛋白。免疫转印分析表明,该融合蛋白具有EF的抗原表位。

猪链球菌2型人源分离株EF单克隆抗体的制备与鉴定

为了解猪链球菌2型(SS2)菌株毒力相关因子的致病机理,建立高效的免疫学检测方法,将SS2胞外因子(EF)抗原性强的区域通过基因克隆、原核表达,经亲和层析纯化的EF蛋白免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术将免疫细鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了4株分泌抗EF蛋白单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞系2G1、5H7、3H4和1F2。间接ELISA测定杂交瘤细胞培养上清的效价为1∶128～1∶512,诱生腹水的抗体效价为1∶104～1∶105。4株McAb腹水的Western blot鉴定表明McAb能特异性的识别EF。以2G1单抗腹水与和EF多克隆抗血清建立的夹心ELISA可特异地检测EF。

检测猪链球菌2型毒力相关蛋白的ELISA法的建立

提纯猪链球菌 2型分离株HA980 1的毒力相关蛋白溶菌酶释放蛋白 (MRP)和胞外因子 (EF) ,制备其抗体。用此抗体建立了Dot ELISA和间接ELISA检测法。分别以菌株ATCC35 2 46和HA980 1为阴性与阳性对照 ,检测 17株猪源链球菌和 1株猪链球菌 2型人分离株。结果显示 ,两种ELISA的检测结果一致 ,MRP和EF的阳性率均为 61% (11/18)。

猪链球菌2型胞外蛋白因子基因片段的克隆与表达

根据猪链球菌 2型 (Streptococcus suis type 2 )胞外蛋白因子 (extracellular factor protein,EF)基因序列 ,设计和合成 1对引物 ,以猪链球菌 2型江苏 98分离株 HA980 1的基因组 DNA为模板 ,通过 PCR技术 ,扩增 epf基因 12 0 7～16 75 bp序列 ,并按正确的阅读框架定向克隆到表达载体 p GEX- 6 p- 1中谷胱甘肽转移酶 (GST)基因的下游 ;将重组质粒转化入大肠杆菌 BL2 1 株 ,经 IPTG诱导可表达相对分子质量约为 4 10 0 0的融合蛋白。用 EF抗血清进行的免疫印迹分析表明 ,含有 epf基因 12 0 7～ 16 75 bp序列编码的肽段的融合蛋白不能被 EF抗血清识别。

2型猪链球菌强毒株与无毒株胞外蛋白的双向电泳图谱比较分析

利用双向电泳技术可以对体外培养的2型猪链球菌强毒株和无毒株进行胞外蛋白质组比较,寻找与毒力相关的蛋白质。2型猪链球菌强毒株和无毒株在无蛋白细菌培养液中37℃摇床培养16h,从培养物上清中获得胞外蛋白。第一向电泳用pH4-7线性IPG胶条进行等电聚焦,第二向电泳用SDS-PAGE凝胶再分离蛋白,经过考马斯亮蓝R350染色,图像扫描后,利用软件分析处理图像。在2型猪链球菌强毒株和无毒株的胞外蛋白质图谱中都分别检测出180±10个蛋白质斑点,它们的蛋白质分子质量分布基本相似;在所检测到的差异蛋白质斑点中,其中有50个蛋白斑点只存在于无毒株中而强毒株中不存在,有52个蛋白斑点只存在于强毒株中而无毒株中不存在,有7个蛋白斑点的表达量相差达5倍以上。这为研究2型猪链球菌的致病机理提供了蛋白质组学方面的信息。

猪链球菌2型epf基因的原核表达及其蛋白纯化

为了克隆、表达SS2菌株epf基因片段,分析蛋白活性,根据GenBank SS2epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,构建原核表达质粒pGEX4T-2-epf,在大肠杆菌中诱导带有GST标签的融合蛋白rEF-GST的表达;亲和层析法纯化融合蛋白rEF-GST,用凝血酶切除重组蛋白中的GST,获得纯化的EF抗原。经Western blot鉴定,EF可与SS2多克隆抗血清发生特异性反应。

用生物信息学方法预测2型猪链球菌98HAH33细胞壁结合蛋白

目的为预测已公布基因组序列的2型猪链球菌(SS2)98HAH33株的细胞壁结合蛋白,以研究它们在SS2致病过程中的作用。方法首先从GenBank获取由SS28HAH33基因组推测蛋白质氨基酸序列,然后根据分选酶底物的结构特征,采用"三部分模式"法鉴别分选酶底物;采用手动方法寻找在具有I型信号肽的蛋白质中具有LysM域、WxL域、胆碱结合域、GW域或S层同源域的蛋白质;利用InterProScan和BlastP服务器,对鉴定的蛋白质进行功能分析。结果共预测出9种分选酶底物,2种具有LysM域的蛋白。YP_001201232、YP_001201531和YP_001201656等3种已证实位于SS2菌体表面;其中YP_001201232为已知毒力因子OSF。另外4种蛋白质的功能分析表明,YP_001201484为糖苷酶,YP_001201544为枯草杆菌素样丝氨酸酶,YP_001199825和YP_001199755可能结合H因子,可能为新的毒力因子。YP_001200959、和YP_001201233等2种功能未知。结论提示SS2的多数分选酶底物可能为SS2的毒力因子,与致病过程相关。

猪链球菌2型胞外因子短片段的原核表达及其免疫保护力

以江苏分离株HA9801基因组DNA为模板,扩增猪链球菌2型(SS2)胞外因子ef基因的1423～2203bp片段,并将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1上,构建了重组质粒pGEX-4T-1-ef。将鉴定阳性的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5mmol/LIPTG诱导8h,表达的融合蛋白rGST-sEF大小为56ku,以包涵体形式存在。Western-blotting显示,rGST-sEF能与全菌兔抗血清发生特异性反应。用自制rGST-sEF亚单位疫苗免疫新西兰兔,以最小致死量HA9801攻击,保护率为60%。结果表明,表达的融合蛋白rGST-sEF具有良好的免疫原性和免疫反应性。

养殖场环境中链球菌胞外蛋白因子PCR检测方法建立

为了快速检测养殖场环境中链球菌的污染情况,试验利用链球菌胞外蛋白因子核苷酸特异序列设计引物,建立养殖场环境中链球菌的PCR快速检测方法。结果表明:从链球菌标准阳性株中获得大小为197 bp的特异性目的片段,而肠毒性大肠杆菌、沙门杆菌、金黄色葡萄球菌等均不能检出;10倍系列稀释结果显示该方法敏感性可达到单个菌株;在处理环境样品时,能检测到4×103cfu/g的环境链球菌。说明该方法具有简单、快速、准确的特点,大大缩短了检测环境中致病性猪链球菌的时间。

猪链球菌2型MRP和EF双基因共表达重组腺病毒载体的构建

旨在构建猪链球菌2型溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)双基因共表达重组腺病毒载体。根据猪链球菌2型MRP和EF的基因序列设计合成2对引物,以猪链球菌2型基因组为模板,扩增MRP基因(第1 801-2 513位)和EF基因(第1 783-2 563位)序列,并克隆到pMD18-T载体。然后将MRP基因、IRES元件和EF基因依次定向克隆至腺病毒穿梭载体pShuttle-CMV中构建重组穿梭质粒pShuttle-CMV-MRP-IRES-EF,再经PmeⅠ酶切,然后转化至含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183-AD-1感受态细胞中,经同源重组获得重组腺病毒载体质粒rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF。PacⅠ酶切线性化该重组腺病毒载体质粒,再转染AD-293细胞进行病毒包装,最后对细胞包装的病毒液进行PCR鉴定。结果表明,克隆的MRP和EF基因测序正确,酶切重组穿梭质粒和腺病毒载体质粒得到特异酶切产物;线性化的重组腺病毒载体质粒rAdeno-CMV-MRP-IRES-EF转染AD-293细胞6 d后也出现明显的细胞病变(CPE),在培养细胞的上清病毒液中也检测到了MRP和EF基因片段。

猪链球菌2型毒力因子及疫苗候选蛋白研究进展

猪链球菌2型(SS2)是一种重要的人兽共患病病原菌,可引起人和猪发生严重疾病。SS2的经典毒力因子有荚膜抗原、溶菌酶释放蛋白、溶血素等。随着研究的深入,又发现了一些与SS2致病性相关的基因和毒力相关元件,以及一些蛋白酶类,这些毒力因子多数具有较好的免疫原性,并在链球菌致病和生长过程中发挥十分重要的作用。通过对一些具有免疫原性的SS2毒力因子蛋白片段进行体外重组表达,有望研制出有效预防SS2感染的基因工程疫苗。

猪链球菌2型胞外因子的融合表达及多克隆抗血清的制备

根据GenBank SS2(Streptococcus suis serotype 2,SS2)epf基因序列设计引物,克隆epf基因片段并进行序列分析,同时亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX4T-2上,将构建的原核表达质粒pGEX4T-2-epf导入大肠杆菌(Eacterium coli)TG1中,诱导融合蛋白EF-GST的表达。经亲和层析、凝血酶切割后,获得纯化的EF为抗原蛋白,用其免疫家兔制备抗血清,成功制备了EF蛋白及其特异的多克隆抗体,为进一步研究EF的功能提供了有用的工具。

猪链球菌H因子结合蛋白截短体的表达、纯化及其结合人血清IgG的活性分析

目的构建带His标签的2型猪链球菌H因子结合蛋白(Fhb)截短表达片段Fhb-N(45-344aa)和Fhb-C(345-664aa)的重组质粒,并在大肠杆菌中表达,获得高纯度的重组蛋白,鉴定其与人血清IgG(hIgG)结合的活性。方法以05ZYH33基因组为模板并设计引物扩增目的片段,构建His-Fhb-N和His-Fhb-C重组表达质粒,利用亲和层析纯化目的蛋白并用Western blot法进行验证。蛋白G亲和层析柱从健康人血清中纯化人IgG(hIgG),Western blot法和生物膜干涉(BLI)鉴定和分析His-Fhb与hIgG结合的活性。结果成功构建了带His标签的原核表达质粒并获得了His-Fhb-N和His-Fhb-C截短表达蛋白,验证出Fhb特异性地与hIgG结合,且结合区域位于Fhb-N(45-344aa)。结论 Fhb能够结合hIgG,结合区域位于Fhb-N。

猪链球菌细胞外蛋白因子Ef基因的克隆与原核表达

采用分子克隆手段,将Ef全长基因克隆至表达载体pGEX-6p-1的Ptac启动子下游,电击转入大肠杆菌E.cohi BL21(DE3)中表达。经PCR扩增和蛋白质凝胶电泳鉴定,表明该EF蛋白获得有效表达,为进一步构建猪链球菌Ⅱ生物工程疫苗提供前期载体。

致病性猪链球菌主要毒力因子基因多重PCR检测

目的建立多重PCR体系,实现猪链球菌毒力相关因子基因cps、mrp、epf(epf*)和sly的同步检测。方法根据上述毒力因子基因核苷酸序列,设计和合成4对特异性引物,通过体系和条件优化,建立多重PCR检测方法,并对72株种属背景明确的实验菌株(其中猪链球菌48株、阴性对照株24株)及49株猪临床分离的链球菌样本进行检测分析。结果48株猪链球菌中,cps2检出率为33.3%(16/48)、mrp检出率为29.2%(14/48)、epf检出率为25%(12/48)、epf*检出率为6.3%(3/48)、sly检出率为54.2%(26/48),上述检测结果与菌株的毒力因子背景情况完全相符;24株阴性对照和49株猪临床分离样本毒力因子检测结果均为阴性。结论多重PCR可用于猪链球菌毒力相关因子CPS2、MRP、EF、Sly的基因检测,特异性和敏感性好,为该病快速诊断和分子流行病学调查提供了新的技术手段。

四川资阳猪源猪链球菌病病原的分离与鉴定

目的四川省部分地区发生的不明原因的猪源人畜共患病病原菌的分离与鉴定。方法采用普通RT-PCR和实时荧光PCR相结合的方法对流感和尼帕病毒的RNA进行检测,在Vero细胞和SPF鸡胚同时进行病毒分离,用血清平板对病料进行细菌分离,同时用革兰染色、生化试验、血清凝集试验和PCR进行鉴定,并对分离到的细菌进行药敏试验。结果排除了流感病毒和尼帕病毒感染的可能性。从病料组织中成功分离到3株链球菌,证实为猪链球菌Ⅱ型。通过对其毒力因子进行鉴定,结果发现溶菌酶释放蛋白(MRP)和细胞外蛋白因子(EF)均为阳性。进一步的药敏试验证实:分离菌株对氨苄青霉素、先锋霉素Ⅵ、羧苄青霉素、复方新诺明、头孢呋肟等抗菌药高度敏感。结论病原为猪链球菌Ⅱ型。

2型猪链球菌AdcR蛋白的原核表达

目的表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2)调控因子AdcR蛋白,为研究其在2型猪链球菌中调控组氨酸三聚体家族蛋白的作用机制奠定基础。方法通过与相关家族蛋白进行同源性比较,在2型猪链球菌05ZYH33全基因组序列中找出编码AdcR的基因。以AdcR基因序列为基础,利用Primer5.0设计引物,采用PCR扩增AdcR基因,经BamHⅠ和HindIII双酶切后将目的片段通过T4DNA连接酶连接至表达载体pET32a,转化大肠埃希菌E.coli BL21,加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L,37℃诱导4h表达AdcR蛋白,然后利用His亲和层析柱纯化AdcR蛋白。结果通过Blast分析,从2型猪链球菌05ZYH33全基因组序列中找到编码AdcR的编码基因05SSU0109。以合成的特异引物PCR扩增出469bp的AdcR片段,连接原核表达载体pET32a后转化E.coli,经IPTG 37℃诱导4h,成功表达出AdcR蛋白,其分子质量单位为40ku,与理论值相符。经His-Tag亲和层析纯化,获得较高纯度的重组AdcR蛋白。结论在大肠埃希菌中成功表达了可溶性的AdcR重组蛋白,为AdcR在2型猪链球菌中调控组氨酸三聚体家族蛋白作用机制研究奠定了基础。

2型猪链球菌细胞分裂蛋白DivIVA的原核表达及纯化

目的利用原核表达系统制备2型猪链球菌细胞分裂起始因子DivIVA重组蛋白并进行纯化,为研究其在调控细胞分裂中的作用奠定基础。方法以2型猪链球菌05ZYH33全基因组为模板,PCR扩增divIVA基因片段,经BamHⅠ和XholⅠ双酶切后将目的片段连接至表达载体pET28a,构建重组表达质粒pET28a-divIVA,经测序鉴定后将重组质粒转化进入表达菌E.coli BL21,以终浓度为0.1mmol/L的IPTG于37℃培养4h,诱导DivIVA蛋白表达。用Ni离子亲和层析柱分离纯化目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot进行检测和验证。结果成功构建重组表达质粒pET28a-divIVA,并在E.coli BL21中表达主要以包涵体形式存在的DivIVA蛋白。包涵体蛋白经8mol/L脲变性溶解后经Ni离子亲和层析柱纯化,获得的目的蛋白经SDS-PAGE检测分子质量为36ku,与预期大小相符;经Western blot检测,该蛋白能被相应抗体特异性识别。结论在E.coli BL21中成功表达并纯化了DivIVA蛋白,为研究该蛋白在2型猪链球菌的细胞分裂机制奠定了基础。