SOX7靶向ERK1/2/PD-L1通路抑制结直肠癌血管生成

目的探讨性别决定区Y框蛋白7(SOX7)对结直肠癌血管生成的影响及潜在作用机制。方法应用免疫荧光检测结直肠癌患者组织样本中SOX7表达水平,之后通过裸鼠、转染SOX7 mimic的人结直肠癌细胞系SW480细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)共培养进一步研究。用Western-blot验证SOX7与ERK1/2/PD-L1对结直肠癌细胞的相关蛋白表达的影响。用CCK8检测SOX7与ERK1/2/PD-L1对HUVEC增殖的影响。通过体外内皮细胞成管实验测定SOX7与ERK1/2/PD-L1对肿瘤血管生成的影响。结果SOX7在人结直肠癌组织中表达被抑制(P<0.01),同时SOX7的过表达抑制了小鼠体内肿瘤生长(P<0.01)。SW480细胞中SOX7的过表达抑制了ERK1/2、c-Jun的表达,并在ERK1/2的激动剂Senkyunolide I的作用下上调了SW480细胞的ERK1/2、c-Jun蛋白表达(P<0.01),逆转了SOX7对SW480细胞中ERK1/2、c-Jun蛋白表达的影响(P<0.01)。HUVEC中SOX7抑制了PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,Senkyunolide I上调了HUVEC的PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,并逆转了SOX7对HUVEC中上述相关蛋白表达的影响(P<0.01)。PD-1/PD-L1 Inhibitor 3抑制了PD-L1、V-EGFR2、p-PI3K、HIF-1α的蛋白表达,SOX7过表达在PD-1/PD-L1 Inhibitor 3的影响下并没有表现出抑制作用。CCK8实验结果显示SOX7过表达显著抑制了HUVEC的增殖能力,Senkyunolide I作用下的两组HUVEC增殖能力较SOX7 NC组与SOX7 mimic组明显上升,PD-1/PD-L1 Inhibitor 3作用下的两组HUVEC增殖能力较SOX7 NC组与SOX7 mimic组明显下降,以上均有明显统计学差异(P<0.01)。成管实验结果显示SOX7过表达抑制了HUVEC的血管生成,Senkyunolide I强烈加速了血管生成,而PD-1/PD-L1 Inhibitor 3血管生成则被显著抑制,以上均有明显统计学差异(P<0.01)。结论SOX7通过ERK1/2/PD-L1通路抑制结直肠肿瘤的增殖和血管生成,SOX7可能是晚期CRC患者临床治疗中潜在的抗血管生成靶点。

人sCD40L基因的克隆及表达

目的 克隆人ｓＣＤ４０Ｌ基因片段，并在原核细胞中表达。方法用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从激活的人外周血淋巴细胞总ＲＮＡ中，扩增ＣＤ４０Ｌ胞外区ｃＤＮＡ，并克隆至载体ｐＧＥＭ－Ｔ。测序验证后，转至载体ＰＱＥ３１中，并在大肠杆菌Ｍ１５中进行表达，最后通过亲和层析柱得到纯化蛋白。结果纯化所得的产物经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ证实，确为人ｓＣＤ４０Ｌ蛋白。结论 应用基因重组法构建了人ｓＣＤ４０Ｌ基因片段，并在原核细胞内成功地进行了表达，为今后进一步研究ＣＤ４０Ｌ与凋亡、疾病的发病机制及临床治疗奠定了基础。

表皮生长因子受体胞外区在哺乳动物细胞HEK293T中的分泌表达和鉴定

目的:融合表达表皮生长因子受体(EGFR)胞外功能区,为制备针对该分子的特异性抗体提供可用的靶标抗原。方法:通过PCR扩增EGFR胞外区基因,将其克隆入真核表达载体pABhFc中,重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,进行EGFR的瞬时分泌表达,纯化获得电泳纯级的分泌蛋白,并通过ELISA、Western印迹、Biacore3000系统对融合蛋白进行鉴定。结果:经测序证实扩增得到了正确的EGFR胞外区基因序列,SDS-PAGE初步确认获得了单、双体的EGFR胞外区,ELISA检测证实双体融合蛋白hFc-EGFR可与商业化的EGF特异性结合,Western印迹检测证实单体融合蛋白His-EGFR可与商业化抗体特异性结合;经Biacore3000蛋白分子相互作用系统测定,双体融合蛋白hFc-EGFR与商业化抗体爱必妥的亲和力达0.5 nmol/L。结论:利用哺乳动物细胞HEK293T分泌表达系统获得了结构正确的单、双体2种类型的EGFR胞外区融合蛋白纯品,将用于抗EGFR特异性抗体的筛选。

重组减毒沙门氏菌疫苗SL3261-pcDNA3．1+/flk-1_(n1-4)抗小鼠大肠癌的生长

目的:研究VEGFR2胞外1-4片段(flk-1_(n1-4))抑制肿瘤生长效应.方法:构建DNA疫苗SL3261-pcDNA3.1+/flk- 1_(n1-4),经ig饲服BALB/c小鼠,随机分为3组,疫苗组,载体对照组和NaHCO_3对照组.对小鼠进行基因免疫.ELISA检测小鼠血清中VEGF水平及特异性抗flk-1_(n1-4)-IgG抗体.流式细胞仪分析免疫小鼠淋巴细胞亚群.DNA疫苗免疫结肠癌荷瘤BALB/c小鼠,测量免疫后荷瘤小鼠肿瘤大小,检测肿瘤微血管密度.结果:免疫小鼠血清中VEGF水平明显降低,并产生高水平的抗flk-1_(n1-4)-IgG抗体.免疫后荷瘤小鼠CD4^+T、CD8^+T值维持较高水平,小鼠结肠腺癌皮下肿瘤生长与载体和NaHCO_3对照组相比明显受抑制,疫苗组小鼠肿瘤质量、体积、平均微血管密度与载体和NaHCO_3对照组相比明显降低(3.64±1.34g vs 8.40±0.66g,8.26±0.44g;2.62±0.54mm^3 vs 6.01±0.14mm^3,5.92±0.25 mm^3;2.06±1.02 vs 6.93±2.34.7.34±4.12;P<0.05).疫苗组小鼠中位生存期较两对照组明显延长.结论:flk-1_(n1-4)能够抑制肿瘤血管内皮细胞生长,达到抗大肠癌生长作用.

人整合素β_3亚基毕赤酵母表达载体的构建及鉴定

目前研究表明整合素β3亚基是多种病毒的细胞表面受体,然而整合素β3亚基与不同病毒受体结合蛋白VAP相互作用的分子机制还不完全清楚。为此,设计引物,采用RT-PCR方法扩增人β3亚基包膜外区约2.1kb片段,克隆入毕赤酵母表达载体pPIC3.5K中。双酶切鉴定挑取阳性克隆pPIC3.5K-β3,测序证实目的基因序列正确。将pPIC3.5K-β3转化毕赤酵母工程菌GS115,在浓度为3.0mg/mL的G418选择培养基上,筛选出含有多拷贝目的基因的阳性菌株,PCR可扩增出约2.1kb的目的条带。阳性菌株经1%甲醇诱导表达,Western-blot可在酵母菌体中检测到约80kDa的目的蛋白条带。上述结果表明,成功构建了人整合素β3亚基毕赤酵母表达载体,筛选获得多拷贝阳性菌株并成功表达,为进一步研究人整合素β3在病毒感染中的作用及其单克隆抗体的制备奠定基础。

重组表达人乙酰胆碱受体α1亚基胞外域蛋白

目的获得大量正确折叠的重组人乙酰胆碱受体(AChR)α1亚基N末端胞外域(ECD)蛋白。方法用RT-PCR方法从TE671细胞中扩增出AChRα1亚基全序列,在此基础上再扩增出ECD基因序列并将其插入到原核表达载体pET16b。以构建的新载体转化E.coliBL21(DE3)pLysS,培养物以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并通过SDS-PAGE比较诱导前后蛋白表达情况。重组蛋白以Ni2+亲和层析纯化。蛋白透析复性后,以ELISA法检测活性。结果PCR产物大小为650 bp,与预计相符;所构建质粒经测序证实ECD核苷酸序列正确,并正确插入载体pET16b。诱导所产生的大量包涵体蛋白经复性后正确折叠且具活性。结论可通过原核表达获得大量正确折叠的可溶性重组人肌肉AChRα1亚基ECD蛋白。

KCNE1胞外N段功能的研究

目的:研究电压依赖性钾离子通道-IKs通道的调节亚基KCNE1胞外肽段(氨基端肽段,简称N段)的功能,探究胞外N段在KCNE1调控IKs通道中的作用。方法:通过分子生物学技术制备KCNE1的N段缺失突变体;利用Western Blot方法了解突变体的蛋白表达情况;以细胞免疫染色方法观察突变体的亚细胞定位情况;以全细胞膜片钳记录技术检测突变体(与KCNQ1共表达)的通道电流特征。结果:成功构建KCNE1胞外N段缺失的突变体KCNE1-ΔN,突变体体外表达正常;与野生型相比:KCNE1-ΔN在细胞内的分布出现蛋白集聚现象;通道的电流密度减小,激活电压相比较出现了明显的左移,即通道的激活速率变快。结论:KCNE1的N段对其蛋白表达无明显影响,但对蛋白的转运起重要作用;N段参与了KCNE1对通道电流大小的调节,以及对通道激活特征的调控。

城市污水厂活性污泥胞外聚合物的三维荧光特性分析

对厦门5个城市污水处理厂活性污泥溶解性有机物SMP,松散型胞外聚合物LB-EPS和紧密结合型胞外聚合物TB-EPS的三维荧光光谱分析表明,SMP,LB-EPS和TB-EPS都有3个明显的特征峰,其中Peak A（Ex/Em=225~230/335~350nm）和Peak B（Ex/Em=275~280/330~350nm）都为类蛋白荧光物质,Peak C（Ex/Em=320~350/420~445nm）为腐殖酸类荧光物质.LB-EPS和TB-EPS荧光峰强度同其对应的TOC浓度有一定相关性.荧光强度综合指数FRI分析表明,微生物副产物更多的存在于TB-EPS中,其FRI总和同TOC浓度呈一定相关性.

乙型肝炎病毒S基因不同区域嵌合丙型肝炎病毒中和抗原表位病毒样颗粒实验研究

目的:串联丙型肝炎病毒(HCV)中和抗原表位嵌合在乙型肝炎病毒(HBV)S基因不同区域并对形成的病毒样颗粒(VLP)进行比较。方法:选取3种HCV中和抗原表位进行串联,分别嵌合在HBV S基因亲水区和氨基端胞外区,构建两种表达载体pCI-NE m S和pCI-S1E_(m) S2。通过10次重复实验转染人胚胎肾细胞293T(HEK293T细胞)后收集培养上清,经过浓缩、纯化制备VLP-NE_(m) S和VLP-S1E_(m) S2。采用电化学发光法对两种VLP进行乙型肝炎表面抗原(HBsAg)定量检测,分析两种VLP含量均值的差异。结果:VLP-S1E_(m) S2的HBsAg均值低于VLP-HBS(P<0.05),而VLP-NE_(m) S与VLP-HBS比较差异无统计学意义(P=0.157)。结论:胞外区嵌合VLP-NE_(m) S与亲水区VLP-S1E_(m) S2浓度结果有区别,胞外区含量较高。

TRAIL胞外段基因克隆及其表达与纯化

目的:克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因（the extracellular regionof the human TRAIL cDNA,TPAILex）,构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段。方法:抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞,用RT-PCR、巢式-PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段oDNA,并克隆到pGEM-T Easy载体中,DNA测序鉴定。将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T,构建重组表达质粒pGEX/TRAILex,用IPTC诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段,GST-Agarose4B层析柱纯化 GST-TRAILex融合蛋白,Western-blot鉴定纯化产物。结果:抗CD3 McAb能诱导正常人外周血单个核细胞TRAIL的高表达,成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因,构建了重组表达载体pGEX/TRAILex,IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段,经12％SDS-PAGE分析,可观察到一分子量和理论值相符（约54kD）的诱导表达带。Kodak软件分析表面GST-TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28％,进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达,用GST-Agarose4B层析柱纯化超声破菌后的上清,每升细菌培养液可得到9.8mg纯度的95％以上的GST-Tex。Western-blot结果证实54kD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应。结?

SEMA6C胞外域在293T细胞中的大量表达及其结构特性的研究

Sema6C是semaphorin蛋白超家族的成员之一,具有调节神经系统发生和发展的生理功能.Sema6C由胞外域、跨膜片段和胞内结构域组成.利用293T细胞表达了Sema6C的胞外域并研究了其结构特性.实验结果表明Sema6C可在293T细胞中大量表达,纯化出的该蛋白N-糖基化修饰,并具有导致背根神经节(DRG)生长冠萎缩的活性,其EC_(50)约为600 pmol/L.用分子筛层析色谱和不变性聚丙烯酰胺凝胶电泳研究该蛋白的结构特性,发现该蛋白在糖基化和去糖基化的状态下均具有稳定的结构和单一的分布形态,其相对分子量分别为190.2和168.8 kDa.此外,分析沉降平衡试验结果表明了该蛋白质形成二聚体.基于以上结果,对Sema6C胞外域的二聚体结构对其致萎缩活性的影响进行了讨论.

三黄鸡CD4胞外区基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

本研究根据鸡CD4分子胞外区基因序列设计合成一对引物,用PCR技术从三黄鸡的cDNA文库中克隆出了其CD4胞外区基因片段,大小为1 206 bp,将该片段插入pMAL-p2X表达载体中,转化大肠杆菌TB1感受态细胞后进行诱导表达,获得了分子量约为87.5 kD的融合蛋白。表达产物经Amylose树脂亲和层析柱纯化,得到了高纯度的鸡CD4胞外区的融合蛋白。利用此蛋白免疫小鼠,制备了高效价的鼠源抗鸡CD4胞外区的抗体,结果表明该蛋白具有良好的抗原性。

猪PD-1胞外区基因的克隆及原核表达

为研究PD-1/PD-L1通路在猪免疫抑制性疾病中的作用,根据猪的PD-1的基因序列,设计扩增其胞外区的引物,从猪PBMC基因组中通过PCR扩增获得猪PD-1胞外区基因片段,测序正确后克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组原核表达质粒pET32-PD1,转化大肠埃希菌DH5α。挑选可疑菌落鉴定正确后转至Rosetta(DE3)进行诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果表明,在37℃、0.5mmol/L IPTG条件下诱导获得33ku的PD-1胞外区融合蛋白,能够被其多抗血清、His标签抗体和人PD-1抗体所识别。本研究为制备其单克隆抗体和研究PD-1/PD-L1在猪免疫抑制性疾病中的作用提供了材料。

脑组织液引流途径与脑内新分区系统的发现

百余年来,基于“细胞学说”的脑科学一直围绕“神经元学说”和“突触学说”展开系列研究,在各类脑细胞和神经网络研究方面的学术成绩斐然。然而,从临床角度来看,多数脑病治疗却并未因学术的进步而取得理想的效果。脑卒中、阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)等依然摧残着人类的健康与尊严,认知、记忆依然是未解之谜[1-2]。回顾历史,从脑结构角度,脑科学研究体系尚存在未被充分认识的结构空间——脑细胞外间隙(extracellular space,ECS)[3]。脑ECS是38~64 nm宽的不规则形、多孔隙结构,占活体脑容积的15%~20%[4],而以往备受重视的脑血管系统仅占据脑容积的3%~5%。以往业界认为ECS只起到细胞间支撑和黏附的物理作用,近年来,随着探测方法的发展和进步,研究结果表明ECS在维持脑局部内环境稳态、细胞间信息传递、细胞迁移,乃至认知、睡眠等方面均发挥着重要作用[5-10]。

新型H7N9禽流感病毒NA蛋白胞外区片段的生物信息学分析及其多克隆抗体制备

旨为以原核表达系统表达、纯化新型H7N9禽流感病毒(安徽株)NA蛋白胞外区片段并制备该蛋白的多克隆抗体。对新型H7N9禽流感病毒神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白胞外区片段进行生物信息学分析,基于大肠杆菌密码子偏爱性进行密码子优化并合成该蛋白编码基因。将构建的重组质粒pET28b-tN9(Truncated N9)转化至E.coli BL21(DE3)、E.coli Rosetta和E.coli Arctic Express(DE3),进行诱导表达,并进行SDS-PAGE鉴定。选取E.coli BL21(DE3)重组菌进行放大培养、IPTG诱导并对诱导产物进行镍柱纯化、SDS-PAGE分析和质谱鉴定。将纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,以Western blotting和间接ELISA法检测抗体特异性及效价。成功表达并纯化目标蛋白,Western blotting显示制备的多克隆抗体能特异性识别重组蛋白和新型H7N9禽流感病毒(上海株),间接ELISA方法检测制备的多克隆抗体,效价为1∶256000。利用原核表达系统高效表达并纯化了tN9蛋白,制备的多克隆抗体效价高,特异性强,旨为深入探索NA蛋白结构及功能、H7N9禽流感病毒致病机制和建立快速检测方法奠定基础。

蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的真核表达优化及其在血清学检测中的效果评价

目的:优化蜱传脑炎病毒包膜糖蛋白胞外区的密码子,提高其在真核系统中的表达量,为蜱传脑炎病毒感染血清的检测提供更为有效的检测抗原。方法:对蜱传脑炎病毒MDJ01株E蛋白胞外区进行真核密码子优化,获得优化的胞外区蛋白基因序列OPT-EC;将抗原基因与海肾萤光素酶基因Rluc融合构建重组质粒pc DNA3.1-Rluc-OPT-EC、pc DNA3.1-Rluc-EC,用重组质粒转染COS7细胞获得融合抗原Rluc-OPT-EC和Rluc-EC,并将融合抗原用于临床感染血清样本的免疫共沉淀检测以评价抗原的灵敏性和特异性。结果:真核密码子优化显著提高了Rluc-OPT-EC的表达量;OPT-EC的检测灵敏度可达86%以上,其对乙型脑炎病毒(JEV)感染血清、黄热病度(YFV)感染血清、禽流感病毒(AIV)感染血清和正常人血清的检测特异度高于90%,但是在西尼罗病毒(WNV)感染血清和登革病毒(DV)感染血清的检测中发生了交叉反应。结论:优化后的E蛋白胞外区蛋白作为TBEV感染的检测抗原,能够有效地区分JEV、YFV感染,但不能区分WNV和DV感染。

鸡干扰素α受体Ⅱ胞外域的克隆及GST融合蛋白原核表达

应用RT-PCR技术扩增鸡干扰素α受体Ⅱ胞外域(CHIFNAR2 EC)基因片段,将扩增产物克隆至pMD-18T,转化J M109感受态。重组质粒与表达载体pGEX-6P-1经双酶切后构建重组表达质粒pGEX-6P-CHIF-NAR2EC,转入BL21,提取质粒酶切和测序鉴定。测序结果与参考序列比较,核苷酸同源性为99%。用IPTG诱导表达,对诱导条件进行初步优化,表达蛋白主要以包涵体的形式存在。通过切胶的方法进行纯化,获取具有较高纯度的融合蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示融合蛋白分子量大小约为50 KD,采用抗GST抗体进行Western Blot,成功检测到特异性目的条带。

电磁辐射对大鼠海马CA1区神经元放电活动影响

目的:观察电磁辐射后海马神经元放电类型及整体电活动的改变,探讨电磁辐射对大鼠海马CA1区空间学习记忆的影响。方法:分别用玻璃电极细胞外记录技术和多导生理记录仪记录大鼠神经元放电。实验使用辐射频率900 MHz,功率10 W/m2的电磁波。在玻璃电极细胞外记录技术中,分别辐照大鼠10,20,30,40,50和60min 6个时点,每个时点重复10次,间隔1 h,比较辐射前后神经元放电频率的变化,实验最后切片观察自发放电类型的改变。在多导生理记录仪实验中,对辐射组大鼠行每周5 d,每天持续6 h,重复十周辐照,通过植入电极对对照与辐射组大鼠在进食时记忆产生的脑电变化进行多次监测,观察海马CA1区峰电位数、最大幅值变化,并取若干电磁辐射后采样序列进行相关性分析。结果:①电磁辐射具有抑制海马CA1区神经元放电频率的作用。电磁辐射后,海马CA1区神经元放电频率降低,但幅度变化不明显。②电磁辐射可改变海马CA1区神经元自发放电类型,使爆发式放电明显增多。③辐射组在5 min内峰电位总个数明显减少,最大幅值降低。④对电磁辐射后采样序列进行相关性分析,辐射组小于对照组,说明电磁辐射后神经元之间是一种趋于抑制性的连接。结论:电磁辐射可能引起传递突触结构和功能上的改变,使海马CA1区神经元放电整体特征和放电类型发生变化,从而导致学习记忆能力减弱。

重组VE-cad-Fc融合蛋白仿生构建细胞外基质

利用基因重组技术设计和构建了一种仿生的双功能仿生细胞外基质蛋白.其基本策略是将人血管内皮钙粘素胞外区(VE-cad)和免疫球蛋白(IgG1)Fc段进行基因融合构建真核表达载体,并利用FreeStyle293真核蛋白表达系统制备融合蛋白VE-cad-Fc,利用Western blot鉴定融合蛋白,并观察了该VE-cad-Fc融合蛋白基质对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)粘附和形态的影响.结果显示,成功克隆了VE-cad胞外段基因,并与Fc段重组形成VE-cad-Fc融合基因.在转染24h后,利用兔抗人VE钙粘素胞外区抗体验明该融合蛋白的免疫抗原性,其分子质量约为90.3KD,进一步的结果证明VE-cad-Fc融合蛋白是以二聚体的形式存在.优化该制备体系最佳表达时间为72h.细胞试验表明,VE-cad-Fc融合蛋白可显著促进HUVECs的粘附和生长.这种工程化的多功能融合蛋白基质在组织工程、再生医学和分子生物学领域有广阔的应用前景.

有机物料还田对黑土胞外酶化学计量特征的影响

冷凉区有机物料(秸秆和有机肥)还田黑土胞外酶计量特征是否受年平均温度的影响,目前缺少定量研究和深入分析。根据气候条件,该研究在黑龙江省西部依据纬度特征选取了12个有机物料还田年限大于5 a的定位试验点,基于有机物料还田种类对土壤胞外酶计量学特征及驱动因子进行了区域性分析。结果表明土壤胞外酶C:N:P在1:0.97:0.61~1:1.13:0.71之间,即有机肥还田(M)和秸秆还田(S)处理下土壤微生物整体面临微生物碳和养分(氮)限制。研究发现随年均温度升高,M和S处理的碳获取酶活性降低,而氮获取酶活性增加。此外,年均温度升高还使得M处理磷获取酶活性降低,而S处理磷获取酶活性增加。总体而言,东北冷凉区有机物料还田黑土微生物能量和养分限制主要受年平均温度直接影响,间接受pH值,土壤C:P等影响。该研究为冷凉区黑土建立合理的碳氮磷施肥模式提供数据支撑,为土壤养分恢复提供理论依据。