蛋白酶体20S亚基β8调控丝裂原活化蛋白激酶激酶/细胞外信号调节激酶通路对肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探究蛋白酶体20S亚基β8(PSMB8)对肾透明细胞癌(ccRCC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以及是否通过调控丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路发挥其作用。方法采用癌症基因组图谱数据库分析ccRCC与正常组织PSMB8 mRNA的表达水平,并通过实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学染色等方法进一步检测PSMB8在ccRCC组织和细胞中的表达情况。构建稳定过表达和敲减PSMB8的细胞株,分别采用CCK-8法和平板克隆实验检测细胞的增殖能力,划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭的能力。对PSMB8共表达基因进行京都基因与基因组百科全书通路富集分析,Western blot检测MEK/ERK通路相关蛋白的磷酸化水平,并加用ERK激动剂C16-PAF处理进行细胞功能学挽救实验。结果与正常组织比较,PSMB8 mRNA和蛋白在ccRCC组织中呈高表达(P均<0.001),且与临床患者的TNM分期显著相关(P<0.001);与阴性对照组比较,过表达PSMB8可以促进786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.021,P=0.039)、迁移和侵袭(P均<0.001),敲减PSMB8可以抑制786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.022,P=0.005)、迁移和侵袭(P均<0.001);PSMB8共表达基因通路富集分析提示其可能与丝裂原活化蛋白激酶通路相关(P<0.001);敲减PSMB8后786-O和ACHN细胞MEK1/2(P=0.017,P=0.016)、ERK1/2(P=0.010,P=0.040)蛋白磷酸化水平及ERK下游因子c-Myc(P=0.043,P=0.038)、c-Fos(P=0.025,P=0.008)和CyclinD1(P=0.006,P=0.047)转录水平均下调;与ERK激动剂C16-PAF处理组比较,敲减PSMB8+C16-PAF组明显抑制786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.003,P=0.002)、迁移和侵袭能力(P均<0.001)。结论PSMB8通过激活MEK/ERK信号通路从而促进ccRCC细胞的增殖、迁移及侵袭。

叶酸抑制同型半胱氨酸诱导的人肾脏系膜细胞增殖

目的观察叶酸对同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导的人肾脏系膜细胞增殖作用的影响及其可能机制。方法人肾脏系膜细胞采用含5%胎牛血清的RPMI1640培养,采用不同浓度Hcy(200、400、600、800、1 000μmol/L)处理细胞,MTT法观察Hcy对人肾脏系膜细胞增殖的影响。选取理想的Hcy浓度,加入不同浓度叶酸(50、100、200、400μmol/L)处理细胞,观察叶酸对细胞增殖的干预作用。相同方法处理细胞后提取总蛋白,Western blot检测转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)和细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulated protein kinases,ERK)表达。结果 Hcy能诱导人肾脏系膜细胞的增殖,促进TGF-β和ERK蛋白表达,呈现剂量依赖性。叶酸干预后能抑制Hcy诱导的细胞增殖,下调TGF-β和ERK蛋白表达。结论叶酸能抑制Hcy诱导的人肾脏系膜细胞增殖,可能与抑制TGF-β和ERK蛋白表达有关。

肾炎宁对LPS诱导人肾小球系膜细胞增殖及细胞外信号调节蛋白激酶的影响

目的探讨肾炎宁对人肾小球系膜细胞(HMC)细胞增殖及细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)的影响。方法应用细胞培养技术,进行HMC培养,采取血清药理学方法,制备肾炎宁药物血清,利用脂多糖(LPS)为刺激因子,应用四唑盐(MTT)比色法和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞的增殖和磷酸化ERK1/2的表达。结果肾炎宁可显著抑制HMC增殖,抑制率在12、24和48h分别为16.0%、15.4%、18.2%,LPS组磷酸化ERK1/2的含量与空白组比较明显升高(P<0.05);中药组与空白组比较,磷酸化ERK1/2含量明显降低(P<0.05);LPS+肾炎宁组与LPS组比较,磷酸化ERK1/2表达明显降低(P<0.05)。结论肾炎宁具有抑制正常培养条件及LPS刺激条件下磷酸化ERK1/2,从而发挥对肾小球硬化的治疗作用。

枸杞多糖对过氧化氢诱导的HK-2细胞自噬及ERK/mTOR通路激活的影响

目的分析枸杞多糖对过氧化氢所致人肾小管上皮细胞(human kidney,HK-2)的损伤情况、细胞内自噬蛋白表达以及细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路的激活情况,探讨枸杞多糖改善其氧化损伤的作用机制。方法体外培养人源性HK-2细胞,根据处理方式不同分为对照组、枸杞多糖组、氧化应激组及干预组。对照组使用细胞培养液;枸杞多糖组使用含有枸杞多糖的细胞培养液;氧化应激组使用含有过氧化氢的细胞培养液;干预组先用枸杞多糖细胞培养液孵育24 h,再滴加过氧化氢孵育30 min,每组处理时间相同。观察每组细胞的生长状态;使用细胞活力检测盒分析各组细胞的存活率;比色法分析胞质所含丙二醛(malondialdehyde,MDA)的量及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活性;蛋白印迹评估胞质内自噬蛋白微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)及ERK/mTOR通路相关蛋白ERK、磷酸化-ERK(phosphorylation ERK,p-ERK)、mTOR和磷酸化-mTOR(phosphorylation mTOR,p-mTOR)的含量。结果与对照组比较,枸杞多糖组细胞生长状态、存活率、胞质所含MDA含量和SOD活性、自噬蛋白LC3及ERK/mTOR通路相关蛋白ERK、p-ERK、mTOR和p-mTOR的含量比较,差异均无统计学意义(均P>0.05);氧化应激组细胞皱缩、悬浮较多,存活率[(51.16±4.85)%]下降、MDA[(4.78±0.81)mmol/L]升高、SOD[(10.11±1.17)U/L]降低,胞质内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ[(0.391±0.058)]降低、p-ERK/ERK[(1.526±0.185)]、p-mTOR/mTOR[(1.423±0.174)]升高(均P<0.05)。干预组与氧化应激组相比,细胞状态好转,悬浮少,存活率[(86.29±4.55)%]上升、MDA[(2.22±0.46)mmol/L]下降、SOD[(18.25±2.33)U/L]升高,胞质内LC3Ⅱ/LC3Ⅰ[(0.846±0.091)]升高、p-ERK/ERK[(0.906±0.127)]、p-mTOR/m[TOR(0.820±0.092)]降低(均P<0.05)。结论枸杞多糖能抑制过氧化氢刺激的HK-2内的ERK/mTOR信号通路,增强细胞的自噬作用,提高细胞存活率,改善其氧化损伤。

ERK1/2 MAPK通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用

目的探讨细胞外信号调节激酶(ERK1/2)丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)通路在基质金属蛋白酶1组织抑制剂(TIMP-1)抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡中的作用。方法将人正义、反义TIMP-1用脂质体法转染大鼠肾小球系膜细胞,并将细胞分为正常对照组、未转染组、空载体组、正义转染组和反义转染组。各组细胞分别用高糖(25 mmol/L)和(或) MEK(ERK1/2通路中的MAPK激酶)特异性抑制剂PD98059(50μmol/L)刺激24 h。应用透射电镜观察细胞内部结构变化。Western印迹观察磷酸化(p)的ERK1/2、P90rsk、Bad及总的P90rsk、Bad、Bcl-2蛋白的表达。结果加入PD98059后,各组细胞内可见凋亡小体形成、细胞皱缩、核固缩、染色体边集及膜泡样突变等现象,与未转染组比较,以反义转染组最明显,凋亡细胞数目最多;正义转染组细胞形态改变不十分明显,凋亡细胞数目相对较少。此外,加入PD98059后, ERK1/2、P90rsk、Bcl-2及Bad的磷酸化明显减少(P<0．05),ERK1/2和P90rsk的磷酸化以正义转染组最明显(P<0．01);总P90rsk、总Bad表达量在各组之间无显著差异。结论ERK1/2通路在TIMP-1抑制高糖诱导的大鼠肾小球系膜细胞凋亡过程中起重要作用。

乙型肝炎病毒X蛋白通过激活细胞外蛋白调节激酶转导机制上调大鼠系膜细胞肿瘤坏死因子-α的表达

目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)X基因编码的蛋白(HBx)导致大鼠系膜细胞(MC)增殖及TNF-α高表达的细胞外蛋白调节激酶(ERK)1/2信号转导机制。方法PCR扩增HBVX基因,然后与真核表达载体PCI-neo质粒连接,构成含有HBVX基因的质粒(PCI-neo-X),采用限制性内切酶法及测序证实。采用脂质体法将PCI-neo-X转染入体外培养的大鼠MC,采用抑制剂U0126阻断ERK1/2通路,观察培养细胞增殖、TNF-α及其mRNA表达,以不加抑制剂作为对照。Western blot检测HBx、ERK1/2及磷酸化ERK(p-ERK)1/2表达。半定量RT-PCR检测TNF-α mRNA表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测培养上清液TNF-α表达。甲基噻唑基四唑(MTT)法检测MC增殖。结果无论是否加入U0126,在转染PCI-neo-X36、48h后,肾小球系膜细胞(GMC)明显表达HBx,细胞TNF-α mRNA的表达加入U0126较不加入U0126显著下降。不加入U0126组上清液TNF-α水平在转染后36h和48h分别为(189.0±18.1)ng/L和(172.3±24.3)ng/L;加入U0126组上清液中TNF-α水平在转染后36、48h分别为(65.6±11.6)ng/L和(84.0±24.6)ng/L,组间不同时间点比较均有显著性差异(Pa<0.05)。加入U0126后MC增殖也显著下降。结论HBx可促使MC增殖,细胞TNF-αmRNA及上清液TNF-α表达均增高,这一作用可能是通过HBx激活ERK1/2信号通路实现的。

胰岛素样生长因子结合蛋白2和细胞外调节蛋白激酶1/2在肾透明细胞癌中的表达及其临床意义

目的探讨胰岛素样生长因子结合蛋白2(IGFBP2)和细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)在肾透明细胞癌(ccRCC)中的表达及其临床意义。方法收集2017年6月至2019年4月在济宁医学院附属医院泌尿外科行手术治疗的174例ccRCC患者的临床资料,并同期选择健康体检中心30例正常健康者的血液标本。应用免疫组织化学方法检测ccRCC患者肿瘤组织、癌旁组织(距肿瘤边缘2 cm)中IGFBP2和ERK1/2的表达情况,并与肿瘤临床分期、组织学分级及肿瘤大小进行相关性分析;同时应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ccRCC患者及健康者血清中IGFBP2、ERK1、ERK2的水平。结果IGFBP2和ERK1/2在ccRCC组织中的表达阳性率[87.93%(153/174),80.46%(140/174)]比癌旁组织[6.67%(2/30),10.00%(3/30)]高,均差异有统计学意义(χ^(2)=92.59,65.87;均P<0.01)。IGFBP2和ERK1/2在直径≥4 cm的肿瘤中的表达阳性率[高于<4 cm的肿瘤表达阳性率,均差异有统计学意义(χ^(2)=7.81,13.02;均P<0.05);IGFBP2和ERK1/2的表达在患者的年龄(χ^(2)=0.78,0.60)、性别(χ^(2)=0.05,1.33)、肿瘤左右侧位置(χ^(2)=0.96,0.57)中比较均差异无统计学意义(均P>0.05)。IGFBP2及ERK1/2的阳性表达率随着临床分期及组织学分级的升高而升高,且在不同组织分级(Z=-8.17,-3.80)和不同临床分期(Z=-5.63,-9.94)间差异具有统计学意义(均P<0.05)。IGFBP2和ERK1/2在ccRCC组织中的表达呈正相关(r=0.32,P<0.05)。ELISA实验结果表明,IGFBP2、ERK1、ERK2在ccRCC患者血清中的表达水平[(858.33±132.89)μg/L,(12.49±1.22)μg/L,(153.61±33.37)ng/L]较健康对照组[(267.65±86.56)μg/L,(8.69±1.80)μg/L,(105.63±12.03)ng/L]明显升高,均差异具有统计学意义(t=11.78,5.53,4.28;均P<0.05)。结论IGFBP2和ERK1/2在ccRCC患者血清及肿瘤组织中均表达升高,组织中组织学分级越高、临床分期越晚、肿瘤体积越大,阳性表达率越高,两者在肿瘤的进展中可能起到协同作用。