人eya2基因小干扰RNA表达载体的构建及表达

目的:设计并构建人eya2(eyes absent2)基因小干扰RNA(siRNA)的真核表达载体,并观察其沉默效果。方法:以人eya2为靶基因,以pSliencer2.1-U6neo质粒为载体,根据人eya2的cDNA序列,设计含有小发卡结构的2条寡核苷酸序列,将其克隆到siRNA表达载体上;转化大肠杆菌DH5α菌株,抽提质粒,测序分析;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,通过荧光分析、Western blot和转录活性实验检测其抑制效果。结果:重组体测序结果与目的序列相一致,证明构建了eya2 siRNA真核表达载体;荧光观察表明siRNA能显著减弱细胞中绿色荧光强度,抑制eya2基因表达;Western blot分析证明构建的siRNA能有效抑制外源性及内源性eya2基因表达;转录活性测定表明,构建的siRNA能有效抑制eya2基因表达。结论:构建了eya2 siRNA真核表达载体,该siRNA能有效地抑制eya2基因表达。

Eya2基因沉默对前列腺癌细胞生物学行为的影响及其机制

目的探讨前列腺癌细胞Eya2表达变化及Eya2基因沉默对前列腺癌细胞生物学行为影响的可能机制。方法采用Western blotting法检测正常前列腺上皮细胞RWPE-1及前列腺癌细胞PC-3、DU145、LNCAP中Eya2蛋白相对表达量。收集对数生长期PC-3细胞,随机分为沉默组和对照组,分别转染Eya2 siRNA以及Negative siRNA,作用24 h。采用Western blotting法及实时荧光定量PCR法检测两组Eya2蛋白及mRNA相对表达量,MTT法检测细胞增殖能力(OD490),流式细胞术检测细胞凋亡能力(细胞凋亡率),Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力(穿膜细胞数),Western blotting法检测蛋白激酶B(AKT)信号通路相关因子p-AKT、Bcl-xl蛋白相对表达量。结果前列腺癌细胞PC-3、DU145、LNCAP中Eya2蛋白相对表达量均高于RWPE-1细胞,沉默组Eya2 mRNA蛋白和相对表达量均低于对照组(P均<0.05)。随着培养时间的延长,两组细胞增殖能力均呈上升趋势,细胞培养2~5天沉默组OD490均低于对照组(P均<0.05)。沉默组细胞凋亡率高于对照组,穿膜细胞数低于对照组(P均<0.05),沉默组p-AKT、Bcl-xl蛋白相对表达量均低于对照组(P均<0.05)。结论沉默Eya2基因可降低前列腺癌PC-3细胞增殖、侵袭能力,提高其凋亡能力;抑制AKT信号通路可能是其作用机制。