基于FⅧ探讨不同脱盐方式的效果及对其成分的影响

目的基于人凝血因子Ⅷ(human coagulation factorⅧ,FⅧ)比较5种脱盐方法的脱盐效果及对FⅧ成分的影响,为蛋白脱盐方式提供参考。方法分别用Sephadex G-25 Medium凝胶、Fractogel EMD BioSEC凝胶、超滤、室温透析和4℃透析5种方法对人FⅧ进行脱盐处理。通过Na^(+)、柠檬酸根离子、甘氨酸去除率评估脱盐效果。通过脱盐前后FⅧ蛋白回收率、FⅧ活性(coagulation factorⅧactivity,FⅧ∶C)、VWF抗原(VWF antigen,VWF∶Ag)、VWF活性(VWF activity,VWF∶Ac)、VWF多聚体及SDS-PAGE分析,评估其对FⅧ成分的影响。结果在脱盐效果方面:Na+在超滤脱盐时去除率最低,为(97.90±0.06)%,Fractogel EMD BioSEC凝胶脱盐去除率最高,为(99.82±0.07)%。除Sephadex G-25 Medium凝胶脱盐与Fractoge EMD BioSEC凝胶脱盐间Na^(+)去除率无统计学意义(P=0.90)外,其他4种方法间Na+去除率存在统计学意义。甘氨酸在超滤脱盐时去除率最低,为(95.78±0.42)%,Fractogel EMD BioSEC凝胶脱盐去除率最高,为(99.81±0.08)%。除超滤脱盐外,其他4种脱盐方法间甘氨酸去除率无统计学意义。柠檬酸根离子在5种方法间去除率均无统计学意义(P=0.85)。对于FⅧ成分的影响方面:超滤脱盐FⅧ∶C、VWF∶Ag、VWF∶Ac及蛋白回收率最高,分别为(18.34±1.99)IU/mL、(11.81±0.33)IU/mL、(12.26±0.58)IU/mL、(97.13±1.37)%。5种方法脱盐前后VWF∶Ac/VWF∶Ag无明显变化。SDS-PAGE及VWF多聚体分析表明,不同脱盐方法对蛋白组成种类影响不明显。结论尽管不同方式脱盐对FⅧ蛋白组成种类无明显影响,但脱盐效果存在差异,不同方式脱盐对蛋白回收率、FⅧ∶C、VWF∶Ag及VWF∶Ac影响显著。蛋白处理过程中,对于脱盐方式的选择应给予足够重视。

免疫性复发性流产患者CD31、CD34及FⅧ表达量变化及其与病理学特征的关系

目的探讨与分析免疫性复发性流产患者CD31、CD34及FⅧ表达量变化及其与病理学特征的关系。方法2021年2月到2022年9月选择在安阳市妇幼保健院诊治的非人为原因流产100例作为研究组,同期选择在安阳市妇幼保健院人工流产患者100例作为对照组,检测两组CD31、CD34、FⅧ表达量情况并进行影响因素分析。结果研究组蜕膜组织CD31、CD34及FⅧ阳性细胞百分率低于对照组(P<0.05)。在两组200例患者中,Spearsman分析显示蜕膜组织中CD31、CD34、FⅧ表达量与免疫性复发性流产都存在相关性(P<0.05)。在两组200例患者中,在免疫性复发性流产作为因变量,以蜕膜组织中CD31、CD34、FⅧ表达量作为自变量,多因素条件Logistic回归显示蜕膜组织中CD31、CD34、FⅧ表达量都为导致免疫性复发性流产发生的重要因素(P<0.05)。结论免疫性复发流产患者多伴随有CD31、CD34及FⅧ的异常表达,免疫性复发性流产患者CD31、CD34及FⅧ表达量变化及其与病理学特征存在明显的相关性。

FⅧ抑制物与狼疮抗凝物对凝血因子检测结果的影响

目的 分析与探讨内源性凝血因子活性假性减低的原因。方法 回顾性分析我院2022年2月至2023年2月门诊与住院病例并分为2组,FⅧ抑制物阳性致内源性凝血因子活性假性减低组6例;狼疮抗凝物(LAC)阳性致内源性凝血因子活性假性减低组15例,检测相关凝血指标,分别将2组稀释3个梯度(1∶2、1∶4、1∶8)后检测内源性凝血因子,对比分析稀释前后数据。结果 FⅧ抑制物组:6例患者活化部分凝血活酶时间(APTT)延长显著且纠正试验均不纠正;内源性凝血因子活性均减低,其中FⅧ活性减低最显著,经3个梯度稀释后FⅧ活性变化均较小,FⅨ、FⅪ、FⅫ活性均恢复为接近正常水平;LAC组:稀释前后FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性结果差异均有统计学意义(P<0.05)且均能恢复至接近正常水平。结论 FⅧ抑制物阳性与LAC阳性均可对内源性凝血因子活性检测结果造成干扰并导致其出现假阳性,但FⅧ抑制物阳性组稀释3个梯度后FⅧ检测结果变化较小,未恢复为接近正常水平,而LAC阳性组FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ活性均恢复为正常水平。

一种我国自主研发rhFⅧ的临床前药代动力学初步比较研究

目的初步研究具有自主知识产权的重组表达人凝血因子(rFⅧ)在研品种的临床前药代动力学。方法建立并优化生色底物活性检测方法,用于测定血浆样品中FⅧ活性浓度(FⅧ∶C);选择市售进口的同类药物Xyntha为参比药物,对只敲除了FⅧ基因的模型小鼠(HA小鼠)分组(n=18)单次尾静脉注射280 IU·kg-1受试药rhFⅧ或参比药Xyntha,在0、0.083、1、3、6、9、24、36和48 h采集血浆样品(30μL/只,每个时间点6个样品),测定其FⅧ∶C并计算药代动力学参数。结果受试rhFⅧ组和参比药Xyntha组给药后,0.083、1、3、6、9、24、36和48 h的血浆FⅧ∶C(IU·mL-1)分别为3.218±1.511 vs 3.616±1.504、2.089±0.593 vs 2.786±1.157、1.953±0.546 vs1.942±0.807、0.613±0.360 vs 1.025±0.321、0.515±0.370 vs 0.894±0.297、0.187±0.082 vs 0.310±0.108、0.061±0.038 vs 0.115±0.040、0.043±0.042 vs 0.023±0.012(P>0.05);主要药代动力学参数:t1/2(h)分别为8.83 vs9.15,AUC0-t(h·IU·mL-1)分别为19.67 vs 27.70,Vd(mL·kg-1)分别为176.37 vs 132.00,CL(mL·h-1·kg-1)分别为13.85 vs 10.00,MRT0-t(h)分别为8.64 vs 9.62。结论受试rhFⅧ单次HA小鼠尾静脉给药280 IU·kg-1后在小鼠体内的药代动力学过程与市售同类进口药物Xyntha基本一致。

FⅧ抑制物:50年纵览

FⅧ抑制物研究时间已超过半世纪。抑制物有两种类型：一种是暴露于外源性FⅧ的血友病患者中产生的（同种抗体），另一种为正常F8基因人群中产生的自身抗体。

中国人获得性血友病A患者中一个FⅧ基因多态性位点的发现

目的研究8例中国人获得性血友病A患者的FⅧ基因变异,尝试寻找与疾病相关的潜在基因位点。方法对患者进行表型检测,包括APTT﹑FⅧ:C和FⅧ抑制物浓度的测定;采用LD-PCR和多重PCR分别检测FⅧ基因内含子22倒位和内含子1倒位,采用PCR产物直接测序的方法对FⅧ基因进行序列分析,寻找突变和多态性位点。结果 8例患者均表现为APTT延长,FⅧ:C降低,并且能够检测出浓度不等的FⅧ抑制物。在FⅧ基因3’UTR区域内发现c.8899G/A(rs1050705)的多态性位点,其等位基因"A"的频率远高于另一等位基因"G"的频率。结论 c.8899 G/A(rs1050705)多态性位点的等位基因频率可能与获得性血友病A患者中FⅧ抑制物的形成存在一定的联系,这对进一步研究该疾病的分子发病机制具有重要意义。

LD-PCR检测FⅧ基因XbaⅠ位点多态性及其在血友病A携带者诊断中的应用

目的建立高特异性的针对凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因内含子22中XbaⅠ多态性位点的连锁分析法,以用于血友病A家系携带者的诊断。方法采用长距离PCR(LD-PCR)方法,特异性地扩增FⅧ基因内含子22中的XbaⅠ位点所在区域,用限制性内切酶XbaⅠ酶切,对5个血友病A家系作家系连锁分析,并对其中可提供多态性信息的家系作携带者诊断。结果家系1中确诊女性携带者1名及1名正常女性成员;家系2中确诊1名女性携带者;而家系3、家系4和家系5该位点无法提供多态性信息。结论基于LD-PCR的FⅧ基因XbaⅠ位点连锁分析方法具有较高的准确性和可靠性,这对临床上诊断血友病A携带者具有积极的意义。

不同温度下3种血液制剂中FⅧ活性分析

目的了解新鲜冰冻血浆、亚甲蓝病毒灭活新鲜冰冻血浆和冷沉淀融化后在不同环境温度中FⅧ活性变化情况。方法随机选取储存于-20℃以下1年内的新鲜冰冻血浆、病毒灭活血浆和冷沉淀置于融浆机中融化后,分别于0、2、4、8和24 h检测3种血液制剂中FⅧ活性[检测标本分别置于(4±2)℃冰箱和20℃恒温水浴箱中保存]。结果融化后(0 h)3种血液制剂的FⅧ的活性分别为(125.8±5.6)、(75.4±3.5)和(58.4±4.2),其中新鲜冰冻血浆中FⅧ活性明显高于亚甲蓝病毒灭活新鲜冰冻血浆和冷沉淀(P<0.001);保存于(4±2)℃和20℃中的3种血液制剂FⅧ活性在24 h后分别为(76.3±5.1)、(39.1±2.9)、(35.1±3.7)和(60.3±4.1)、(35.2±3.0)、(31.7±4.6),其活性均明显下降(P<0.001)。结论 3种血液制剂中新鲜冰冻血浆中的FⅧ活性较高,且均随保存时间的延长而活性下降。建议在(4±2)℃保存融化后的血浆制剂,并尽快输注(最好在8 h内输注)。

vWF-△Pro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FⅧ基因转移

多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除.前肽缺失突变体vWF(vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白.为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响,将vWF-ΔPro基因和融合SspDnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达,用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式,并检测了其对FⅧ的结合力;用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ,并用Coatest法检测由其产生的生物活性.结果显示,vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式,其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近;vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21ng/mL,活性为1.78±0.18IU/mL,明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12ng/mL和1.05±0.13IU/mL),与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19ng/mL和1.95±0.22IU/mL),表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性.为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据.

11个甲型血友病家系FⅧ基因的RFLPs连锁分析

应用Southern印迹杂交方法和PCR新技术,对东北地区11个甲型血友病家系检测FⅧ基因内的Bcl Ⅰ和Xba Ⅰ位点的RFLPs和基因外Stl4/Taq I RFLPs,分析了FⅧ基因的连锁状况,7名肯定携带者中4名能提供多态信息,4名可疑携带者之中2名可确定为缺陷FⅧ基因的携带者,1名可确定为正常FⅧ基因。为婚姻、生育指导和产前基因诊断提供依据。进一步明确了应用PCR技术联合进行多个位点的RFLPs连锁分析进行甲型血友病基因诊断的可行性及优越性。

江苏汉族人群FⅧ基因内微卫星DNA多态性研究及其在基因诊断中的应用

为研究江苏地区汉族人群FⅧ基因内微卫星DNACA 13、CA 2 2的多态性 ,并探讨其在血友病甲基因诊断中的应用价值 ,我们用聚合酶链反应 (PCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)的方法 ,分别检测了 86名 (131条X染色体 )和 74名 (10 9条X染色体 )江苏汉族人CA 13、CA 2 2的长度多态以及三个血友病甲家系成员这两个微卫星的长度变化。结果发现CA 13、CA 2 2分别有 7种、4种等位片段 ,多态信息量 (polymorphisminformationcontent,PIC)分别为 0 5 14 9、0 5 2 0 2。用这两个微卫星进行家系连锁分析 ,两个家系得到诊断 ,并检出一名携带者。本研究表明微卫星标记CA 13、CA 2 2具有高多态性 ,联合应用这两个微卫星 ,理论上可使家系完整的血友病甲携带者检出率及产前诊断率达 77%。

倒位PCR法检测血友病A FⅧ基因内含子22/1倒位

目的建立血友病A(hemophilia A,HA)FⅧ基因第22内含子倒位PCR检测法,并初步应用于HA直接基因诊断。方法应用倒位PCR(inversion-PCR,I-PCR)方法对24个HA家系中所有先证者的FⅧ基因22内含子倒位进行检测,对检测阳性者的母亲进一步用上述方法行携带者诊断,并对其中1例进行羊水产前基因诊断。检测阴性者再行内含子1倒位筛查。结果 24个HA家系中,7例先证者的F基因内含子22倒位检测为阳性,阳性检出率、可诊断率分别为29.17%、100%,未发现内含子1倒位;7例内含子22倒位突变阳性患者的母亲有6例为倒位携带者,羊水诊断未发现内含子22/1倒位。结论 I-PCR法能准确地检测F基因22内含子倒位突变,可应用于HA患者及携带者FⅧ基因22内含子倒位基因诊断及产前诊断。

PCNA和FⅧR:Ag在氪激光诱导大鼠脉络膜新生血管中的表达及意义

目的研究在氪激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管(CNV)中,增殖细胞核抗原(PCNA)和因子Ⅷ相关抗原(FⅧR∶Ag)的表达,探讨CNV形成的过程及特征。方法对7组42只BN大鼠单眼行氪激光光凝,分别在光凝后第3天及1、2、3、4、8和12周行眼底血管荧光造影检查(FFA)、病理学检查,并用免疫组织化学方法分别检测PCNA和FⅧR∶Ag蛋白表达。结果激光光凝后第1～12周的FFA检查见光斑处圆盘样荧光渗漏。病理学检查光凝后第1周可见视网膜下新生血管。免疫组织化学检查,光凝后第3天光凝区PCNA表达最强,3d～4周逐渐减弱,损伤区各种细胞处于增殖状态,是CNV形成的主要阶段。第1周时光凝区内FⅧR:Ag阳性表达围成管状,CNV开始形成;2～4周FⅧR∶Ag表达增强(P<0.05),CNV形成最多,达到高峰;此后FⅧR∶Ag保持较强的阳性表达(P>0.05),CNV持续存在。结论通过氪激光诱导BN大鼠CNV形成,至少在光凝后第1～12周内CNV形成并稳定存在,作为CNV发病机制基础研究的动物模型是可靠的。

东北地区健康汉族人群FⅧ基因内含子13(CA)n多态分布的研究

目的 :探讨东北地区健康人群FⅧ基因内含子 13的二核苷酸CA重复多态分布 ,为甲型血友病基因诊断提供依据。方法 :应用同位素 (α 3 2 PdCTP)掺入的PCR方法检测无遗传关系的健康汉族个体 44例 ,男 3例 ,女41例 ,总计 85条X染色体。结果 :检出 7种不同长度的等位基因片段 ,其长度在 130～ 15 0bP之间 ,从最短片段开始 ,依次为A ,B ,C ,D ,E ,F ,G。各等位基因频率为 :A :0 .0 2 35 ,B :0 .76 47,C :0 .0 2 35 ,D :0 .0 471,E :0 .0 70 6 ,F :0 .0 5 88,G :0 .0 118。计算可提供信息量为 40 .16 % ,实际检测到的杂合子率为 39.0 2 % (16 /4 1)。结论 :FⅧ基因内含子 13(CA)

急性心脑血管血栓性疾病患者血浆FⅦ:C、FⅧ:C、凝血酶原及纤维蛋白原的变化

目的:检测凝血因子Ⅶ、Ⅶ、Ⅱ、Ⅰ的活性,研究其在急性心脑血管血栓性疾病中的变化。方法:分别采用凝血活酶时间、部分凝血活酶时间、发色底物法及凝血酶时间法测定了急性心肌梗死(AMI)和急性缺血性脑卒中(AIS)病人血浆FⅦ:C、FⅧ:C、凝血酶原及纤维蛋白原相对活性。结果:AMI病人血浆FⅦ:C为98.3 ％±36.7％,与青年组的104.0％±29.4％和老年组的114.9％±23.6％比较无明显差异(P值均>0.05),而AIS病人为152.9％±30.3％,较青年组和老年组显著升高(P值均<0.001)。AMI病人血浆FⅧ:C为234.2％±57.9％,明显高出青年组的101.2％±32.6％和老年组的116.4％±35.7％(P值均<0.001)。但AIS病人FⅧ:C±为85.5％±32.6％,低于老年组(P<0.05)。AMI和AIS病人血浆凝血酶原活性分别为130.2％±14.7％和128.0％±29.4％,高于青年组的108.0％±7.7％(P<0.001和0.01)和老年组的106.1％±19.4％(P值均<0.001)。AMI和AIS病人血浆纤维蛋白原活性分别为207.2％±53.0％和174.3％±28.5％,二者均显著高于正常青年组的103.3％±11.6％(P值均<0.001)和老年组的143.8％±16.8％(P<0.001和和0.01)。结论:AMI病FⅧ:C增高,AIS病人FⅦ:C增高;二者血浆凝血酶原和纤维蛋白原活性均高于正常水平。

iNOS,FⅧ-RAg在喉鳞状细胞癌的表达与血管形成的关系

目的探讨诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和FⅧ-RAg在喉癌组织中的表达及其侵袭转移过程中的作用。方法采用免疫组化Elivi-sion法检测30例喉鳞状细胞癌、10例声带息肉中iNOS和FⅧ-RAg的表达,并检测微血管密度(MVD)。结果30例喉癌组织中iNOS的阳性表达率为80%(24/30),声带息肉中iNOS的阳性表达率为10%(1/10)。FⅧ-RAg在喉癌组织和声带息肉的阳性表达率分别为70%(21/30),0%(0/10)。FⅧ-RAg,iNOS阳性表达两组间差异有统计学意义,P<0.025。喉癌组织和声带息肉中MVD分别为65.85±13.06,5.64±3.57,两组间差异有统计学意义(P<0.001)。结论iNOS,FⅧ-RAg在喉癌组织中的高表达,提示iNOS,FⅧ-RAg可促进血管形成,可能与喉癌的发生、发展和侵袭转移有关。因此,选择性抑制iNOS和FⅧ-RAg可减少肿瘤的发展和侵袭转移。

多器官功能不全综合征患者血浆中VWF、FⅧ和AT-Ⅲ变化的临床意义

目的:研究多器官功能不全综合征(MODS)患者血管性血友病因子(VWF)、Ⅷ因子(FⅧ)和抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)的变化,并探讨其临床意义。方法:40例MODS患者被列为观察对象。测定血浆VWF、ⅧF和AT-Ⅲ水平,同时计算患者的急性生理和慢性健康评分(APACHEⅡ)。20例健康者为正常对照。结果:MODS组血浆VWF和FⅧ水平明显高于正常对照组,AT-Ⅲ水平低于正常对照,P<0.01;MODS组中,死亡组血浆VWF和FⅧ水平明显高于生存组,差异有统计学意义,P值分别为P<0.01和P<0.05。MODS患者血浆VWF和FⅧ与APACHEⅡ评分呈正相关,r分别为0.716和0.705,AT-Ⅲ与APACHEⅡ评分呈负相关,r=-0.752,P<0.01。结论:VWF、FⅧ和AT-Ⅲ在MODS的发病过程中起着重要的作用,并与MODS患者病情严重程度相关,可以作为反映MODS患者预后的指标。

930701血浆和中纯FⅧ国家标准品FⅧ：C检测结果及分析

９３０７０１血浆和中纯ＦⅧ国家标准品ＦⅧ：Ｃ检测结果及分析中国药品生物制品检定所１０００５０刘大英，沈琦，云志宏笔者用一、二期凝结法和基质显色法，对９３０７０１血浆和中纯ＦⅧ国家标准品ＦⅧ：Ｃ进行了标定，现将结果报告如下。１材料和方法１．１标准品ＷＨ...