FⅧ因子抑制患者可通过花费经济的免疫吸附途径得到有效控制

背景 使用葡萄球菌蛋白A作血浆免疫吸附可去除免疫球蛋白和免疫复合物,因此,它可能对获得性或先天性血友病患者去除FⅧ因子抑制物有效。在有抑制物的患者采用这种治疗方法可花费更少,尤其可在急诊部门使用。

10例血友病A患者的FⅧ因子基因内含子22倒位分析

１０例血友病Ａ患者的ＦⅧ因子基因内含子２２倒位分析吴竞生，陈云弟，王寅文，陈美珏，王祖贻，潘理明，汪健，丁浩血友病Ａ（ＨＡ）是凝血因于Ⅷ（ＦⅧ）基因缺陷所致的Ｘ－连锁隐性出血性遗传病。ＦⅧ因子基因突变类型众多，１９９３年发现约一半重型ＨＡ是由ＦⅧ基因...

凝血因子FⅧ全cDNA的克隆

凝血因子Ⅷ(F Ⅷ)缺乏症——A型血友病是一种常见的X性连锁的遗传性出血性疾病,在男性中的发病率为1/5000。在血循环中,F Ⅷ与vWF(von Willebrand Factor)结合成复合物存在。在内源性凝血系统中,F Ⅷ作为一种辅酶在Ca^(2+)及磷脂的存在下参与凝血因子F Ⅸa对凝血因子FX的激活作用。目前对A型血友病的治疗主要采用输注全血或F Ⅷ血浆浓缩剂,虽然具有一定的疗效,但由于F Ⅷ在血浆中含量极微(0.2μg/ml)。

人凝血因子Ⅷ几种冻干保护剂的比较

目的探讨不同冻干保护剂对人凝血因子Ⅷ(FⅧ)制品在冻干及干热(100℃,30min)过程中的作用。方法同批次人FⅧ样品在相同冻干条件及一定保护剂(0.3%甘氨酸、1.5%蔗糖、1.0%白蛋白)组成的基础上,改变甘氨酸、蔗糖、白蛋白、木糖醇和精氨酸5种冻干保护剂的含量或种类,组合成6组配方,对不同配方冻干及干热后FⅧ制品外观、复溶后澄清度及FⅧ活性等进行分析比较。结果Ⅰ组(3%甘氨酸):冻干和干热后制品成形最好,但复溶后均有少量絮状物;Ⅱ组(5%蔗糖):冻干和干热后制品均萎缩,冻干过程部分制品水份未抽干,冻干后澄清度较好,干热后部分有少量絮状物;Ⅲ组(2%白蛋白):冻干和干热后制品成形较好,但复溶后均有絮状物;Ⅳ组(5%木糖醇):冻干后制品萎缩,复溶后澄清度最好,干热后膨胀,复溶后有大量絮状物;Ⅴ组(1.2%精氨酸):冻干和干热后制品萎缩,但复溶后澄清度均较好;Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸):冻干后制品膨胀,复溶后澄清度较好,干热后进一步膨胀,复溶有大量絮状物。各组冻干后FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率均较高(≥84.2%);干热后差别明显,其中Ⅲ组(2%白蛋白)FⅧ活性≥9.3 IU/ml,回收率最高(≥90.4%),而Ⅳ组(5%木糖醇)和Ⅵ组(5%木糖醇+1.2%精氨酸)FⅧ活性≤0.94 IU/ml,回收率极低(≤9.8%)。结论在冻干及干热过程中不同冻干保护剂作用差异较大,甘氨酸赋形作用较好,精氨酸对制品中蛋白稳定作用明显,白蛋白对FⅧ活性保护作用最佳;较高浓度的蔗糖不利于冻干过程中水份的去除,木糖醇不适于作为需100℃干热处理的人FⅧ冻干保护剂。

血友病A患者凝血因子Ⅷ抑制物筛查及分析

本研究通过检测重型血友病A(hemophilia A,HA)患者凝血因子Ⅷ(FⅧ)抑制物,探讨抑制物阳性患者基因突变情况。选取58例一期法检测FⅧ:C均小于1%HA患者,以APTT法为基础进行FⅧ抑制物筛查,筛查阳性者用Bethesda法进行FⅧ抑制物定量分析。以基因组DNA为模版,对抑制物阳性患者FⅧ12、14、16外显子进行基因扩增,PCR产物通过直接测序检测突变情况。结果表明:58例HA患者中4例(6.9%)抑制物检测为阳性,FⅧ12、14、16外显子基因均未发现基因突变。结论:本组病例HA患者抑制物阳性率低于国外文献报道,抑制物产生的原因有待于进一步研究。

凝血因子Ⅷ制剂及其临床应用

本文主要介绍了凝血因子Ⅷ制剂冷沉淀和浓缩物的制备方法和性质特点,临床应用适应症、输注剂量、使用方法、注意事项和不良反应及预防,仅供同道参考。

一种人凝血因子Ⅷ产品的临床前药物安全性评价

目的评价1种以新鲜冰冻血浆为原料制备的人凝血因子Ⅷ(FⅧ)产品的药物安全性。方法按照《中国药典》方法对小鼠和豚鼠腹腔注射FⅧ做异常毒性试验;采用体外试管法进行兔红细胞体外溶血试验;采用同体自身对照法进行兔血管刺激性试验;对FⅧ制备过程的添加剂残留量进行毒理分析。结果小鼠和豚鼠经腹腔注射本品<30min均无异常反应,观察期结束时,小鼠平均增加体重>50%,豚鼠平均增加体重>20%;体外溶血试验在15、30、45min,60、120和180 min均未观察到兔红细胞溶血,也未见红细胞聚集;多次和单次静脉注射新西兰兔,除部分对照组和试验组动物出现由于给药时机械操作或反复给药引起的与本品无关的红斑和轻微血管扩张外,均未见明显异常;本品的铝残留量<30μg/L,抗-A抗-B血凝素均<1∶64,Tween-80残留量<100μg/m L、磷酸三丁酯残留量<10μg/m L、聚乙二醇残留量<0.5 g/L。结论该FⅧ产品经动物及体外的药理毒理试验和病毒安全性试验证明是安全的,可用于临床。

两种设备虹吸法制备冷沉淀凝血因子的质量和方法比较

目的通过2种设备(虹吸法)制备冷沉淀凝血因子的质量和方法的比较,选择合适的制备冷沉淀的设备。方法用贝克曼ACL-7000的原厂配套试剂分别对冷沉淀进行凝血因子Ⅷ、纤维蛋白原的测定。结果血浆融化箱制备冷沉淀中凝血因子Ⅷ含量为80.8-317.9IU,平均值为152.08 IU;纤维蛋白原含量为190.5-759.6 mg,平均值为373.02 mg,全自动冷沉淀制备仪制备冷沉淀中凝血因子Ⅷ的含量为80.2-326.7 IU,平均值为181.3 IU;纤维蛋白原含量为209.1-880.2 mg,平均值为424.8 mg,凝血因子Ⅷ差异有统计学意义(P<0.01)纤维蛋白原差异没有统计学意义(P>0.05),均达到了国家标准。结论2种方法都能制备出符合根据《全血及成分血质量要求》规定的冷沉淀,冷沉淀中凝血因子Ⅷ的含量不少于80 IU/袋,纤维蛋白原含量不少于150 mg/袋,但全自动冷沉淀制备仪制备的冷沉淀凝血因子质量及方法优于血浆融化箱法,适宜推广。

女性A型血友病F基因突变分析

报道罕见的女性A型血友病1例,并对其凝血因子进行基因突变分析。患者,女,65岁,因为跌倒后右胸痛2d入院,院内查体提示胸壁皮下血肿,双下肢等长,髋屈曲及内旋受限。测定凝血指标提示APTT61.3s,正常血浆纠正后为41.3s,而PT、FIB、TT均正常。有既往出血史。F活性为2%,F活性为200%,vWF:Ag为120%,vWF:RCof100%,vWF:CBA128%,F结合分析正常;髋关节X片提示:双侧髋臼发育不良,髋关节骨关节炎。临床诊断为血友病A型。提取该患者外周血DNA,根据NM000132之凝血因子F基因序列设计合成了其第14外显子特异的引物,行聚合酶链反应扩增,并对扩增产物进行测序分析,测序结果与标准序列进行比较,发现该患者出现4111A→C杂合突变,使1314位氨基酸由苏氨酸变为脯氨酸,产生一错意突变,该突变未见其它文献报道。

海南地区人群中FⅩⅢ Val 34 Leu多态性的研究

目的:研究海南地区汉族人群、黎族人群、脑梗死患者、冠心病患者FⅧ val 34Leu分布特点。方法:用聚合酶链反应、限制性片段长度多态性分析及核苷酸顺序测定检测205名汉族正常人、236名黎族正常人、196例脑梗死患者、188例冠心病患者(心肌梗死/非心肌梗死,55/133)FⅩⅢA链 Val 34 Leu多态性。结果:汉族人群、黎族人群、脑梗死组未发现Val 34 Leu多态性,在冠心病组中发现1例Val 34 Leu杂合子。结论:FⅧ Val 34 Leu变异在中国人群中不是多态性,与缺血性心脑血管疾病没有关联,不是中国人群中防止动脉血栓性疾病的保护性因素。

人皮肤微血管内皮细胞的分离、培养及鉴定

背景:目前,国内外研究多采用酶消化法结合免疫磁珠法分离微血管内皮细胞,然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而,如何简化人皮肤微血管内皮细胞分离、培养,同时又能获得到高纯度的内皮细胞体外培养方法成为研究热点。目的:探索一种简便高效的来源于糖尿病患者皮肤微血管内皮细胞的体外培养方法,观察细胞生长状态并进行鉴定。方法:利用临床上糖尿病伴足部慢性创面截肢后,肢体近心端皮肤和局部创面周围皮肤真皮浅层组织。经剪碎后采用贴壁法和短时少量应用胰酶法得到人皮肤微血管内皮细胞,传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。结果与结论:1实验成功获取人皮肤微血管内皮细胞,原代培养的人皮肤微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁,第10天进入对数生长期,第12至13天细胞浓度达80%,传代细胞较原代细胞生长活跃,培养5-7 d可长满培养瓶底,呈"铺路石样"排布;2免疫组织化学染色结果显示,培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原呈阳性,细胞阳性率达100%;3MTT法测得培养第2、4、5代人皮肤微血管内皮细胞的生长曲线呈倒"S"形。4结果证实,应用贴壁法,并在培养过程中少量短时应用胰酶法,可获得大量高纯度的人皮肤微血管内皮细胞。

人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

背景:建立高纯度的人胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。目前,国内外研究多采用三步酶消化法结合免疫磁珠法分离胎盘微血管内皮细胞,然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而,如何简化人胎盘微血管内皮细胞分离步骤,同时又能提高目标细胞纯度的体外培养方法成为研究热点。目的:探索一种简便高效的从早期绒毛组织中分离人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法,观察细胞生长状态并进行鉴定。方法:利用健康孕6-8周孕妇行人工流产后的绒毛组织,经两步酶消化法和非连续Percoll密度梯度离心得到人胎盘微血管内皮细胞,传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。结果与结论:实验成功获取人胎盘微血管内皮细胞,原代培养的人胎盘微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁,第10天进入对数生长期,第12至13天细胞浓度达80%,传代细胞较原代细胞生长活跃,培养5-7 d可长满培养瓶底,呈"铺路石样"排布。免疫荧光化学结果显示,培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原双荧光染色呈阳性,细胞阳性率达100%。MTT法测得培养第5代人胎盘微血管内皮细胞的生长曲线呈倒"S"形。结果证实,应用两步酶消化法、非连续Percoll密度梯度离心法分离细胞,并利用胰酶消化法和反复贴壁法纯化细胞,可获得大量高纯度的人胎盘微血管内皮细胞。

血管生成素对糖尿病大鼠股骨头血管新生及渗漏的影响

目的探讨血管生成素1(angi.Poietin-1,Ang-1)对糖尿病大鼠股骨头微血管新生及渗漏的影响。方法建立速发型链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)糖尿病大鼠模型,随机分为正常5周组(CON1)、10周组(CON2)及15周组(CON3),糖尿病5周组(DM1)、10周组(DM2)及15周组(DM3),每组10只。墨汁灌注观测股骨头微血管密度;摘取模型动物股骨头组织,免疫组化分析凝血因子Ⅷ(FⅧ)表达;原位杂交分析血管内皮生长因子(VEGFmRNA)表达强度;RT-PCR分析Ang-1的mRNA表达。结果糖尿病大鼠股骨头随病程发展,Ang-1、FⅧ因子表达上升,与正常组相比有显著性差异(P<0.01)。VEGFmRNA表达量均高于正常组(P<0.01);微血管密度加大,显示血管增生、渗漏。结论糖尿病股骨头Ang-1与VEGFmRNA相互协同或拮抗分别促进微血管增生、抗血管渗漏。表达于血管内皮细胞的FⅧ及VEGFmRNA与微血管密度(MVD)变化存在正相关。

冷沉淀制备仪虹吸法与低温水浴箱融化离心法制备冷沉淀的对比研究

目的探讨冷沉淀制备仪虹吸法制备冷沉淀的优势应用。方法采集30袋全血,先分离出新鲜冰冻血浆冰冻保存。后解冻将其随机等分成两组,分别采用冷沉淀制备仪虹吸法及低温水浴箱融化离心法制备冷沉淀,并按照国家标准分别对各组冷沉淀产品的纤维蛋白原和FⅧ因子含量进行检测分析。结果冷沉淀制备仪虹吸法与低温水浴箱融化离心法制备的冷沉淀质量都符合质量管理标准,但制备仪虹吸法生产的冷沉淀中纤维蛋白原和FⅧ因子的含量要比低温水浴箱融化离心法高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论用冷沉淀制备仪虹吸法制备冷沉淀操作简单易行,安全可靠,省时、省力且其产品质量均符合国家标准并优于低温水浴箱融化离心法,有实际应用价值。

冷沉淀制备的控制环节

冷沉淀富含FⅧ因子、VWF、纤维蛋白原、XIII因子、纤维连接蛋白等，临床应用范围和用量近年来呈明显上升趋势，除用于治疗血友病A，在烧伤、外伤、DIC等方面应用越来越多。冷沉淀中FⅧ因子极其不稳定，从全血采集到新鲜冰冻血浆的制备再到冷沉淀的制备的很多环节都会影响冷沉淀的最终质量，如何对相关的各个环节进行控制，制备优质的冷沉淀，笔者单位通过多年的探索与改进，积累了一套经验，与同行共讨。

腺相关病毒包装条件优化及重组AAV8/hFⅧ基因治疗血友病A小鼠的实验研究

目的评价携带人凝血因子FⅧ(hFⅧ)的重组腺相关病毒(AAV)血清型8(AAV8/hFⅧ)病毒治疗血友病A(HA)小鼠效果。方法应用pAAV-CB-EGFP,pH22(AAV2血清型)和pfΔ6(腺病毒辅助质粒)摸索在HEK-293细胞中AAV的包装条件,pH22、pfΔ6及pAAV-CB-EGFP质粒按照1∶1∶1的比例进行转染,免疫荧光显微镜观察四个条件(包括10 cm培养皿转10μg质粒,20 cm培养皿分别转20、30和40μg质粒)的病毒包装效果。应用最佳包装条件在HEK-293细胞中包装AAV2-EGFP,通过冻融法获得AAV2粗提液,感染HEK-293细胞和16095细胞,应用荧光显微镜观察包装效果。应用最佳转染条件将pAAV-TTR-hFⅧ、pH28、pfΔ6按1∶1∶1的比例转染HEK-293细胞获得AAV8/hFⅧ,两轮的氯化铯梯度离心法纯化病毒,以8×10^12 vg/kg剂量经尾静脉注射HA小鼠进行基因治疗,活化部分凝血活酶时间(APTT)测定分析FⅧ的活性。结果20 cm培养皿转染20μg质粒的条件能够在24、48和72 h都达到最佳的转染效果,且该条件包装的AAV2粗提液在16095细胞中具有较高的感染率。HA小鼠体内AAV8/hFⅧ能够在注射后12周仍有维持在治疗水平的FⅧ活性。结论利用优化包装条件制备的AAV8/hFⅧ能够在HA小鼠体内有效维持治疗水平的FⅧ活性达12周。

大鼠骨髓基质细胞体外诱导分化为内皮细胞实验研究

目的探讨骨髓基质细胞 (BMSC)向内皮细胞分化的可行性。方法无菌条件下获取BMSC ,实验组以 40 0ng/ml重组人粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM CSF)为诱导剂 ,进行体外诱导分化 ;对照组用 164 0培养液培养。 8d后进行免疫组化染色进行特异性内皮细胞标志物鉴定。结果分化后的细胞在光镜下具有内皮细胞的形态学特征 ;免疫组化染色证实实验组诱导后的细胞为内皮细胞。结论BMSC在高浓度rhGM CSF作用下 。

冷沉淀质量事件可追溯性的调查与分析

目的探讨与分析形成冷沉淀质量事件的关键因素并予以整改。方法收集中心2016年10月到2018年8月冷沉淀制品的外观、容量、FⅧ因子含量、纤维蛋白原含量和无菌检查五个项目抽检结果,从采血到冷沉淀制备的每个环节分析形成质量事件的因素。结果2017年及之前的冷沉淀质量控制抽检结果显示不合格数为13袋,其中FⅧ因子含量未达标数占据84.62%,纤维蛋白原含量不达标数占据23.08%,其中1袋为二者均不合格。通过对上述各环节的不断改进和控制,2018年1~8月冷沉淀质量控制抽检合格率高达96.88%。结论杜绝质量事件的关键是保证血液的冷链系统,最大限度的减少冷沉淀在常温下的时间。要保证各个环节的严格受控,制备优质冷沉淀,除了配备必要的设备外,还要提高员工的质量意识和效率意识,提高专业技能。

抗人凝血因子Ⅷ-C1C2区单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备抗人凝血因子Ⅷ(FⅧ)C1C2区单克隆抗体(mAb),并对其进行生化和生物学鉴定。方法采用基因重组技术表达FⅧ-C1C2区蛋白(rFⅧ-C1C2),以rFⅧ-C1C2免疫8周龄Balb/C小鼠,小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合后,ELISA法筛选阳性克隆,制备稳定分泌抗rFⅧ-C1C2mAb的细胞株,并对mAb进行生化和免疫学鉴定。结果获得一株抗rFⅧ-C1C2区单克隆抗体阳性克隆2B11,命名为SZ-133。琼脂糖双扩散鉴定为IgG1类,Westernblot法证实SZ-133可与rFⅧ-C1C2区蛋白及重组的全长FⅧ特异性结合,但不影响FⅧ的凝血活性。结论表达了rFⅧ-C1C2,并制备出了抗人凝血因子Ⅷ的单克隆抗体SZ-133,它能特异识别血浆及重组的FⅧ,有可能用于基础和临床应用研究。