柚皮素通过下调Akt/mTOR信号通路抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞纤维化

目的:基于网络药理学分析和转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的大鼠肾NRK-49F细胞模型探究温阳振衰颗粒的药物成分柚皮素通过蛋白激酶B(PKB/Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路发挥抗纤维化作用的潜在机制。方法:网络药理学分析温阳振衰颗粒治疗肾纤维化的关键成分和作用靶点。Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测柚皮素对NRK-49F细胞的毒性作用,以及对TGF-β1诱导的NRK-49F细胞纤维化的影响。观察NRK-49F细胞形态变化;qRT-PCR实验检测NRK-49F细胞中纤维化相关因子I型胶原(Col I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和纤连蛋白(FN)的mRNA表达;Western blot实验检测NRK-49F细胞中Col I、α-SMA、FN、Akt和mTOR的蛋白表达。结果:网络药理学的结果表明,温阳振衰颗粒的关键成分柚皮素可通过作用于Akt等靶点治疗肾纤维化。CCK-8实验结果显示,0~50μmol/L的柚皮素对NRK-49F细胞无明显毒性作用。50μmol/L的柚皮素可抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞纤维化和增殖(P<0.01),并下调Col I、α-SMA和FN蛋白的表达(P<0.01)。柚皮素抑制TGF-β1诱导的Akt和mTOR蛋白磷酸化(P<0.01)。结论:柚皮素是温阳振衰颗粒中甘草的黄酮类成分之一,可通过下调Akt/mTOR信号通路抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞纤维化。

温阳振衰颗粒通过调节lncRNA LOC103694972/miR-29c-3p减轻TGF-β1诱导NRK-49F细胞的纤维化

目的探讨温阳振衰颗粒通过lncRNA LOC103694972/miR-29c-3p对TGF-β1诱导的大鼠肾间质成纤维细胞(NRK-49F)的纤维化的影响。方法采用TGF-β1(10 ng·mL^(-1))处理NRK-49F细胞24 h,构建纤维化细胞模型。造模结束后给予空白血清、温阳振衰颗粒含药血清和缬沙坦胶囊含药血清干预。CCK-8法检测温阳振衰颗粒对NRK-49F增殖的影响。实时荧光定量PCR检测LOC103694972和miR-29c-3p表达。Western blot法检测纤维化相关因子Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达。同时研究过表达或沉默LOC103694972,温阳振衰颗粒含药血清对TGF-β1干预的NRK-49F细胞的影响。双荧光素酶报告实验检测LOC103694972与miR-29c-3p之间的调控作用。结果温阳振衰颗粒明显减弱TGF-β1诱导的细胞增殖和LOC103694972的表达(P<0.05),促进miR-29c-3p的表达(P<0.05),其干预效果与缬沙坦胶囊含药血清效果一致。双荧光素酶实验证实LOC103694972靶向调控miR-29c-3p。过表达LOC103694972促进温阳振衰颗粒含药血清干预下TGF-β1诱导NRK-49F细胞的活力,以及α-SMA蛋白、CollagenⅠ蛋白的表达(P<0.05)。而沉默LOC103694972具有相反的效果(P<0.05)。结论温阳振衰颗粒通过下调LOC103694972促进miR-29c-3p的表达,进而抑制TGF-β1诱导的NRK-49F细胞纤维化。

中华绒螯蟹肝胰腺R和F细胞及其脂类储存的电镜研究

电镜下研究了中华绒螯蟹不同生长发育时期 (9月份卵巢处于快速发育阶段 ,12月成熟阶段、胚胎发育 4～ 14天和卵孵出以后 )肝胰腺R和F细胞的结构及其脂类储存。肝胰腺的脂类主要以脂肪滴 (L)的形式存在于R细胞中。R细胞在不同阶段L的存在形式和脂类的储存量不同 ,细胞数量也有所不同 ,显示R细胞对不同生长时期的敏感性。F细胞的结构特征是胞质中的发达的粗面内质网系统 。

益气解毒方通过Wnt/β-catenin信号通路诱导鼻咽癌5-8F细胞凋亡

目的基于Wnt/β-catenin信号通路探讨益气解毒方(黄芪、黄连、白花蛇舌草等)对鼻咽癌5-8F细胞凋亡的作用机制。方法(1)将5-8F细胞分为空白对照组、益气解毒方不同浓度组(0.25、0.5、1.0、2.0 mg·mL^(-1))及顺铂组(4μg·mL^(-1)),采用实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)监测细胞的增殖情况。(2)将5-8F细胞分为5组:空白对照组、益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、HLY7810μmol·L^(-1)组、HLY7810μmol·L^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、IWR-18μmol·L^(-1)组,采用RTCA监测细胞的增殖;药物干预36 h后,采用Annexin V-FITC/PI双荧光染色法检测细胞凋亡率;JC-1荧光探针法检测细胞线粒体膜电位;Western Blot法检测细胞β-catenin、Wnt5a/b、Bcl2及Bax蛋白的表达水平。结果与空白对照组比较,益气解毒方不同浓度组(0.25、0.5、1.0、2.0 mg·mL^(-1))的5-8F细胞增殖曲线均明显降低;益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、IWR-18μmol·mL^(-1)组的细胞凋亡率显著升高(P<0.01),线粒体膜电位明显降低,β-catenin、Wnt5a/b及Bcl2蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),Bax蛋白表达显著上调(P<0.01),Bax/Bcl2比值显著升高(P<0.01)。与益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组比较,HLY7810μmol·L^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组的5-8F细胞增殖曲线明显升高,细胞凋亡率显著下降(P<0.01),线粒体膜电位明显升高,β-catenin、Wnt5a/b及Bcl2蛋白表达明显上调(P<0.05,P<0.01),Bax蛋白表达显著下调(P<0.01),Bax/Bcl2比值显著降低(P<0.01)。结论益气解毒方能够抑制鼻咽癌5-8F细胞增殖,并诱导细胞凋亡,其机制与抑制Wnt/β-catenin信号通路相关。

不同部位鹿茸水提液对NRK-49F细胞促增殖作用的研究

目的:研究鹿茸不同部位水提液体外对细胞促增殖作用的差异。方法:以大鼠肾成纤维细胞NRK-49F作为模型,以MTT法检测鲜鹿茸上、中、下三部分水提液的促细胞增殖率,以BCA法检测样品蛋白浓度,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法分析样品蛋白组成的差异。结果:上、中、下部鹿茸样品可溶性蛋白含量分别为17.89、16.04和6.89 mg·mL-1,从顶端到基部,鹿茸可溶性蛋白的含量依次降低。加样24 h时,鹿茸上部和中部样品分别在蛋白浓度800μg·mL-1和600μg·mL-1时达到最大促增殖率,分别为66.76%和64.36%,下部样品在1 000μg·mL-1时达到最大促增殖率,为58.87%。作用48 h后,鹿茸上部和中部样品均在蛋白浓度800μg·mL-1时达到最大促增殖率,分别为219.56%和215.86%,下部样品在蛋白浓度1 000μg·mL-1时达到最大促增殖率,为169.20%。鹿茸样品对细胞的增殖促进作用远大于10%胎牛血清。3个部位样品蛋白组成的SDS-PAGE图谱差异不大。结论:所有样品对细胞增殖均有促进作用,且呈现浓度依赖效应。不同部位样品主要蛋白组成差异不大。

鼻咽癌组织中Gli1的表达及其对5-8F细胞增殖和迁移的影响

目的:研究神经胶质瘤相关癌基因1(Gli1)在鼻咽癌组织中的表达及其对鼻咽癌细胞5-8F增殖和迁移的影响。方法:采用荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测40例鼻咽癌组织和12例正常鼻咽组织中Gli1的表达;设计并合成针对Gli1基因的RNAi片段,将其感染5-8F细胞,蛋白质印迹法检测Gli1蛋白表达;MTT实验、平板克隆形成实验、细胞划痕实验和Boyden实验分别研究Gli1基因沉默后对5-8F细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果:Gli1在鼻咽癌组织中的表达明显高于正常鼻咽组织,将siRNA-Gli1-01和siRNA-Gli1-02转染入5-8F细胞后,5-8F细胞中Gli1蛋白表达水平明显降低,细胞的增殖、迁移和侵袭能力明显减弱。结论:Gli1基因的表达异常与鼻咽癌的发生发展相关,有望成为鼻咽癌早期诊断和预测预后的生物分子标志物。

肿瘤内皮标志物8同型物Ⅰ基因真核表达载体的构建及其在HEK293F细胞中的表达

目的:构建肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因真核表达载体,实现TEM8在HEK293F细胞中的外源表达。方法:用PCR技术扩增TEM8基因,经限制性酶切、连接、转化,插入pcDNA3.1(+)-EGFP真核表达载体,并通过脂质体将TEM8表达质粒转染至HEK293F细胞中,Western印迹检测TEM8的表达。结果:PCR扩增得到TEM8基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-TEM8-EGFP并转染HEK293F细胞,经G418加压筛选及有限稀释法得到生长性状良好、表达效率高的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293F;Western印迹证明过表达细胞系TEM8-EGFP/HEK293F显著表达TEM8蛋白。结论:构建了表达TEM8的重组HEK293F工程细胞系TEM8-EGFP/HEK293F,为进一步研究TEM8的生理功能奠定了基础。

HEK293F细胞瞬时表达PDGFR-β/Fc蛋白的条件优化

为优化HEK293F细胞瞬时转染条件,提高PDGFR-β的蛋白表达量,采用聚乙烯亚胺(Polyetherimide,PEI)为转染试剂,将质粒p XLG-PDGFR-β/Fc与PEI混匀聚合后加入到细胞悬液,37℃,φ=6%CO2,180 r/min悬浮振荡培养,培养7 d后收集样品,ELISA检测PDGFR-β蛋白的浓度。对细胞密度、DNA浓度和m(DNA):m(PEI)、聚合时间以及添加物(丙戊酸钠、葡萄糖和蛋白胨)进行优化。结果显示,HEK293F细胞瞬时转染的最佳条件为:细胞密度4×106cells/m L、DNA浓度2.0μg/106cells、m(DNA):m(PEI)为1:2、聚合时间5 min。同时,48 h内添加3 mmol/L丙戊酸钠,第3天补加葡萄糖和1 g/L的蛋白胨TN1可使PDGFR-β/Fc的蛋白表达量明显提高。实验表明,经过对HEK293F细胞瞬时表达PDGFR-β的转染条件的优化,蛋白表达量可达55 mg/L,为更大规模瞬时转染生产PDGFR-β/Fc蛋白奠定了基础。

大黄素对TGF-β1诱导的NRK-49F细胞增殖的影响

目的:研究大黄素对TGF-β1诱导的肾成纤维细胞株(NRK-49F)增殖以及降低FN(纤连蛋白),Col-I(I型胶原蛋白),Smad2/3蛋白及基因表达的机制。方法:采用CCK8法检测不同浓度大黄素对NRK-49F细胞增殖情况的影响;终浓度为20、40、80μmol/L的大黄素处理NRK-49F细胞30min后,模型组和观察组均以TGF-β1以5ng/mL的终浓度刺激24h,并收集细胞,蛋白质免疫印迹技术(Westernblot)检测FN,Col-I,Smad2/3蛋白表达水平,实时荧光定量PCR(Real-timePCR)检测FN,Col-I,Smad2/3mRNA表达。结果:模型组FN,Col-I,Smad2/3蛋白和基因的表达明显增加,大黄素含药血清组能抑制NRK-49F细胞增殖,且抑制FN,Col-I,Smad2/3蛋白和的表达(P<0.05)。大黄素浓度越高,抑制作用越明显,成一定的量效关系。结论:大黄素干预后,可改善肾纤维化程度,保护NRK-49F细胞模型损伤。

前列腺癌LNCaP-AI+F细胞外泌体促进基质细胞WPMY-1功能活化

目的:探讨前列腺癌外泌体对基质细胞WPMY-1迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法:超速离心法提取前列腺癌LNCaP-AI+F细胞上清中的外泌体,电镜观察外泌体的典型形态结构,Zetaview检测外泌体的粒径分布,Wb鉴定外泌体标志蛋白及其他相关蛋白。将WPMY-1细胞与前列腺癌外泌体(40μg/ml)共孵育后,激光共聚焦显微镜观察WPMY-1细胞对PKH67标记的外泌体的摄取情况,Transwell实验检测WPMY-1细胞迁移和侵袭能力,qPCR检测IL-8、PDGFB和MMP9等三种肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblast,CAF)分子表达水平,Wb检测EGFR和ERK1/2蛋白磷酸化水平。结果:电镜下可观察到典型茶托状外泌体结构,外泌体粒径分布集中在100 nm左右,其标志蛋白CD63和ALIX的表达证实了所提取颗粒为外泌体。此外,外泌体还表达EGFR、HER2和SRC等三种与前列腺癌进展相关的蛋白。WPMY-1细胞与外泌体共孵育后,共聚焦显微镜下可看到该细胞摄取大量外泌体,明显促进WPMY-1细胞的迁移和侵袭能力(均P<0.01);与对照组比较,外泌体(40μg/ml)处理后WPMY-1 IL-8、PDGFB及MMP9表达水平增高(P<0.05或P<0.01);且外泌体促进了WPMY-1细胞EGFR和ERK1/2的磷酸化(P<0.01)。结论:前列腺癌细胞可通过外泌体作用于基质细胞WPMY-1,使其高表达多种CAF相关分子,促进EGFR和ERK1/2的磷酸化,增强其迁移和侵袭能力。

百令胶囊加还原型谷胱甘肽含药血清对NRK-49F细胞增殖的影响

目的探讨百令胶囊加还原型谷胱甘肽(GSH)含药血清对大鼠间质成纤维细胞NRK-49F增殖及信号分子转化生长因子-β1(TGF-β1)、Sma和Mad相关蛋白(Smad)表达水平的影响。方法采用单侧输尿管梗阻组大鼠制备含药血清(百令胶囊1.5 g/kg联合GSH 300 mg/kg)和不含药血清。将对数生长期细胞分为正常对照组、模型组(10 ng/ml TGF-β1)、阴性对照组(10 ng/ml TGF-β1+10%不含药血清)和药物干预组(10 ng/ml TGF-β1+10%含药血清)。显微镜下观察各组细胞形态,采用CCK8检测各组细胞增殖情况;流式细胞仪检测各组细胞周期分布;RT-PCR检测各组细胞TGF-β1/Smad信号通路转录水平的表达;Western blot检测各组细胞TGF-β1/Smad信号通路蛋白表达水平。结果与正常对照组相比,模型组和阴性对照组NRK-49F细胞增殖活性增加(P<0.05),G0/G1期细胞减少(P<0.05),S期细胞增加(P<0.05),增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、α肌动蛋白(α-SMA)、磷酸化Smad2/Smad2(p-Smad2/Smad2)、p-Smad3/Smad3的表达上调(P<0.05);与阴性对照组相比,药物干预组NRK-49F细胞增殖活性下降(P<0.05),G0/G1期细胞增加(P<0.05),S期细胞减少(P<0.05),PCNA、Cyclin D1、CollagenⅠ、α-SMA、p-Smad2/Smad2、p-Smad3/Smad3的表达下调(P<0.05)。结论百令胶囊加GSH含药血清可能通过抑制TGF-β1/Smad的表达,抑制肾间质纤维化。

豆芋异黄酮的制备及其对RIN-m5F细胞氧化损伤的保护作用

以豆芋(Apios americana Medik.)为原料,采用乙醇热回流提取、乙酸乙酯萃取,以异黄酮质量浓度为指标,优化大孔树脂富集工艺,并对得到的豆芋异黄酮(记为AI-3)抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制能力及对胰岛瘤细胞RIN-m5F氧化损伤的保护作用进行探究。结果:优化的D101型大孔树脂富集工艺为:上样质量浓度1.5 mg/m L,体积分数80%乙醇溶液(p H 6)洗脱,洗脱体积80 m L(4倍柱体积),所得AI-3得率为0.44%(占豆芋干基质量),异黄酮质量分数50.83%;AI-3对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基、2,2’-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基的半抑制质量浓度分别为19.51、3.40 μg/m L,铁离子还原抗氧化能力为387.83 μmol/mg,对α-葡萄糖苷酶活力的半抑制质量浓度为235.97 μg/m L;AI-3在0~300 μg/m L范围内,RIN-m5F细胞存活率同空白对照组相比无显著差异(P>0.05),且25~300 μg/m L时可极显著提高RIN-m5F氧化损伤细胞的存活率(P<0.01),300 μg/m L时细胞存活率达84.19%,高于阳性对照组。结论:D101型大孔树脂可有效富集豆芋异黄酮,所得AI-3具有较强的抗氧化、α-葡萄糖苷酶抑制活性及RIN-m5F细胞氧化损伤保护作用。研究结果为开发预防糖尿病等代谢综合征功能性食品提供了理论依据。

尾静脉注射BA/F3-JAK2V617F细胞构建BALB/c小鼠真性红细胞增多症模型

目的应用BA/F3-JAK2V617F细胞构建BALB/c小鼠真性红细胞增多症模型。方法40只雌性BALB/c小鼠,随机分为空白对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、芦可替尼组。接种前各组小鼠均接受1.0 Gay的全身辐照,24 h内分别接种不同浓度的BA/F3-JAK2V617F、BA/F3-Blank细胞,并给予相应药物28 d。末次给药后,采血、取材进行血液学检测、骨髓涂片、组织病理学检测。结果与空白对照组比较,中、高剂量组外周血红细胞数(RBC)、血红蛋白(HGB)、红细胞比容(HCT)升高,骨髓中粒细胞系、粒红比减少,红细胞系增加,体重明显下降,脾脏重量、脾指数明显增大;低剂量组HGB、脾指数显著升高,粒细胞系、粒红比减少。与高剂量组比较,芦可替尼组RBC、HGB、HCT、骨髓中红细胞系、脾脏重量、脾指数均明显降低,体重、骨髓中粒细胞系、粒红比均明显升高。空白对照组病理检测无明显变化;低剂量组胸骨骨髓造血活跃;中剂量组脾脏髓外造血,胸骨、股骨造血活跃;高剂量组脾脏髓外造血,腰椎、股骨、胸骨骨髓造血活跃;芦可替尼组胸骨骨髓造血活跃。结论BALB/c小鼠经1.0 Gay剂量的全身辐照后,尾静脉注射BA/F3-JAK2V617F 1.0×106~1.6×10^(6)个细胞可成功构建真性红细胞增多症动物模型,符合真性红细胞增多症的生物学特点。

益气解毒方通过TGF-β1/SMAD3信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的研究益气解毒方对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并从转化生长因子β1(TGF-β1)/SMAD3信号通路探讨其对增殖、迁移和侵袭的作用机制。方法(1)将鼻咽癌细胞分为4组:溶剂对照组、益气解毒方0.5 mg·mL^(-1)组、益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)2μg·mL^(-1)组,采用实时无标记细胞功能分析仪(real time cellular analysis technology,RTCA)监测细胞增殖;创伤愈合实验检测细胞迁移;药物干预24 h后,侵袭小室法检测细胞侵袭;Western Blot法检测细胞β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白的表达水平。(2)将鼻咽癌细胞分为5组:溶剂对照组、TGF-β110 ng·mL^(-1)组、TGF-β110 ng·mL^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组、LY320088210μmol·L-1组,采用实时无标记细胞功能分析仪监测细胞增殖;创伤愈合实验检测细胞迁移;药物干预24 h后,侵袭小室法检测细胞侵袭;Western Blot法检测细胞β-catenin、E-cadherin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白的表达水平。(3)随机将裸鼠分为模型组、益气解毒方组和5-Fu组。皮下部位注射细胞悬液制备鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,基本成瘤后,5-Fu组每2 d腹腔注射1次,其余组每天灌胃给药1次,连续3周。每隔3 d测量瘤体体积1次;Western Blot法检测各组组织中β-catenin、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达水平。结果与溶剂对照组比较,益气解毒方(0.5、1.0 mg·mL^(-1))组的细胞增殖曲线均下降,细胞迁移和侵袭能力均降低(P<0.05,P<0.01),且E-cadherin蛋白表达明显升高(P<0.01),β-catenin、N-cadherin、TGF-β1、SMAD3蛋白表达均明显降低(P<0.05,P<0.01)。与模型组比较,益气解毒方组的鼻咽癌移植瘤体积明显减小(P<0.05),且益气解毒方组移植瘤组织中的β-catenin和N-cadherin蛋白表达明显下调(P<0.05,P<0.01),E-cadherin蛋白表达明显上调(P<0.01)。加入TGF-β1信号通路激活剂和抑制剂后,与益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组比较,TGF-β110 ng·mL^(-1)+益气解毒方1.0 mg·mL^(-1)组的TGF-β1、SMAD3、β-catenin和N-cadherin蛋白表达水平均明显升高(P<0.05,P<0.01),且细胞增殖、迁移和侵袭的能力明显增强(P<0.01)。结论益气解毒方能够通过调控TGF-β1/SMAD3信号通路抑制鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

IL-17F、ANKRD49在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的分析白细胞介素-17F(IL-17F)和锚蛋白重复结构域49(ANKRD49)在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其临床意义。方法收集60例NSCLC患者NSCLC组织及癌旁正常组织。采取免疫组化法检测NSCLC组织、癌旁组织ANKRD49、IL-17F表达情况。采用多元线性回归分析ANKRD49、IL-17F表达与NSCLC临床病理特征的关系;绘制Kaplan-Meier生存曲线分析ANKRD49、IL-17F表达情况对患者生存率的影响。结果NSCLC组织ANKRD49、IL-17F表达阳性率高于癌旁组织(P<0.05)。TNMⅠ期、无淋巴结转移、高分化程度的NSCLC组织中IL-17F表达阳性率分别高于TNMⅡ和Ⅲ期、有淋巴结转移和低分化程度(P<0.05);TNMⅢ期、有淋巴结转移、低分化程度的NSCLC患者癌组织中ANKRD49表达阳性率分别高于TNMⅠ和Ⅱ期、无淋巴结转移和中高分化程度者(P<0.05)。TNM分期是NSCLC组织IL-17F表达的影响因素;淋巴转移、分化程度是NSCLC组织ANKRD49表达的影响因素(P<0.05)。NSCLC患者IL-17F表达阳性者生存率高于阴性者(P<0.05),而ANKRD49表达阳性者生存率低于阴性者(P<0.05)。结论IL-17F、ANKRD49在NSCLC患者癌组织中的表达较高,且均与NSCLC患者预后关系密切,可作为评估NSCLC患者预后的潜在靶点。

^(18)F-FDG PET/CT在非小细胞肺癌病理亚型鉴别诊断中的应用

肺癌是我国发病率极高的肿瘤之一,非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌主要的组织学类型。NSCLC病理亚型已经成为患者预后的重要影响因素。^(18)F-FDG PET/CT作为一种新型无创的影像学检查技术,可以同时获得病灶的葡萄糖代谢与CT影像特征信息,并且随着PET/CT影像组学的出现以及不断进步,更多的定量成像特征可被提取观察,对NSCLC诊疗具有重要意义。目前^(18)F-FDG PET/CT葡萄糖代谢参数、CT影像特征及影像组学与NSCLC病理亚型关系的研究成果备受瞩目,值得进一步探索。

自制鼻咽解毒胶囊含药血清对鼻咽癌细胞系5-8F存活、凋亡的影响及其机制

目的观察自制鼻咽解毒胶囊含药血清对鼻咽癌细胞系5-8F存活、凋亡的影响,并探讨其机制。方法将对数生长期5-8F细胞分为8组,5%、10%、15%、20%、25%、30%鼻咽解毒胶囊含药血清组分别加入5%、10%、15%、20%、25%、30%鼻咽解毒胶囊含药血清,20%空白血清组加入20%不含药血清,对照组细胞正常培养,培养24、48 h,CCK-8法检测各组细胞存活率。将对数生长期5-8F细胞分为4组,低剂量组加入5%鼻咽解毒胶囊含药血清,中剂量组加入20%鼻咽解毒胶囊含药血清,高剂量组加入30%鼻咽解毒胶囊含药血清,阴性组细胞正常培养,培养24 h,流式细胞术检测细胞凋亡率,RT-qPCR法检测细胞中K-RAS、RAF mRNA相对表达量,Western blot法检测细胞中K-RAS、RAF、p-ERK1/2蛋白相对表达量。结果与对照组比较,20%含药血清组、25%含药血清组、30%含药血清组培养24 h及48 h的细胞存活率降低(P均<0.05);与20%空白血清组比较,25%含药血清组培养48 h和30%含药血清组培养24、48 h的细胞存活率降低(P均<0.05);与同组24 h比较,30%含药血清组培养48 h的细胞存活率降低(P<0.05)。与阴性组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组凋亡率升高(P均<0.05);与低剂量组比较,中剂量组、高剂量组细胞凋亡率升高(P均<0.05);与中剂量组比较,高剂量组细胞凋亡率升高(P<0.05)。与阴性组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组的K-RAS、RAF mRNA相对表达量降低(P均<0.05);与低剂量组比较,中剂量组、高剂量组K-RAS、RAF mRNA相对表达量降低(P均<0.05);与中剂量组比较,高剂量组K-RAS、RAF mRNA相对表达量降低(P均<0.05)。与阴性组比较,高剂量组K-RAS蛋白、RAF蛋白、p-ERK1/2蛋白相对表达量降低,中剂量组的K-RAS、RAF蛋白相对表达量降低,低剂量组RAF蛋白相对表达量降低(P均<0.05);与低剂量组比较,高剂量组K-RAS、RAF、p-ERK1/2蛋白相对表达量及中剂量组K-RAS、p-ERK1/2蛋白相对表达量降低(P均<0.05);与中剂量组比较,高剂量组K-RAS蛋白相对表达量降低(P<0.05)。结论自制鼻咽解毒胶囊含药血清能抑制5-8F细胞存活,并促进细胞凋亡,且呈剂量依赖性,尤以30%鼻咽解毒胶囊含药血清剂量为最佳,作用机制可能与其可抑制MAPK/ERK信号通路有关。

circHIPK3促进鼻咽癌细胞5-8F迁移和侵袭的机制

目的探讨环状RNA HIPK3(circHIPK3)在鼻咽癌(NPC)细胞迁移和侵袭中的作用及其分子机制。方法检索公共数据库,运用高通量基因表达数据库(GEO)分析NPC组织及非癌组织中circHIPK3表达水平;合成circHIPK3-siRNA转染NPC 5-8F细胞;采用RT-qPCR、Western blot、细胞划痕、CCK-8和Transwell等实验方法,研究确定circHIPK3-siRNA干扰效果后,检测它对细胞增殖、迁移和侵袭及潜在下游基因CDH1、CDH2、MMP2、MMP9、IL-6/STAT3表达的影响。运用转录组测序技术分析5-8F细胞circHIPK3-siRNA干扰后显著差异表达的基因,以期找到介导circHIPK3促癌作用的关键基因。结果与非癌组织相比,NPC组织中circHIPK3表达明显增加(P<0.05)。使用siRNA特异性敲低5-8F细胞中circHIPK3的表达后,与对照组相比,si-circHIPK3组细胞增殖速率降低(P<0.05),si-circHIPK3组细胞划痕闭合率降低(P<0.01),同时si-circHIPK3组细胞迁移和侵袭的细胞数目减少(P<0.05)。此外,与对照组相比,si-circHIPK3组下游基因CDH1 mRNA和蛋白的表达量升高(P<0.001),CDH2、MMP2、MMP9、IL-6/STAT3 mRNA和蛋白的表达量减少(P<0.05)。进一步测序分析显示,circHIPK3-siRNA转染的5-8F细胞中AL645922.1、SCO_(2)、AL136295.1和ISY1-RAB43表达上调(P<0.05),BIVM-ERCC5、FAM47E-STBD1、INO80B-WBP1、NAIP、C15orf38-AP3S2、BCL2L2-PABPN1和SMIM11B表达下调(P<0.05)。结论NPC组织中circHIPK3表达显著升高。circHIPK3通过调节E-Cadherin、N-Cadherin、MMP2、MMP9和IL-6/STAT3的表达,促进NPC细胞5-8F的增殖、迁移和侵袭。AL645922.1和BIVM-ERCC5等基因可能在circHIPK3介导的促进NPC 5-8F细胞迁移和侵袭中发挥关键作用。

重组人干扰素λ1在HEK-293F细胞中的表达及鉴定

目的 采用HEK-293F细胞瞬时转染表达重组人干扰素λ1(recombinant human interferonλ1,rhIFNλ1),并进行鉴定。方法 通过2种信号肽[T细胞受体(T cell receptor,TCR)和天然信号肽(nature signal peptide,NSP)]、3种载体[pcDNA3.4、泛染色质开放原件(ubiquitous chromatin opening element,UCOE)、PFR]和目的基因rhIFNλ1构建6种信号肽-载体组合的重组质粒,以HEK-293F为宿主细胞,摇瓶规模瞬时转染表达rhIFNλ1。选择NSP及载体UCOE构建低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ,瞬时转染HEK-293F细胞,表达产物经阳离子交换层析(HiTrap SP FF)、蓝胶层析(HiTrap Blue HP)和分子筛凝胶过滤层析(Sephacryl S-100 HR)3步纯化,纯化产物进行Western blot及反相HPLC分析,并检测质谱分子量及N-末端氨基酸序列。结果 6种重组质粒经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。随着转染时间的延长,6种表达产物的表达量逐渐增加,转染6 d时最高,达10~20 mg/L。低糖基化rhIFNλ1重组质粒UCOE-Q46-λ经双酶切及测序鉴定,证明构建正确。重组质粒UCOE-Q46-λ转染HEK-293F细胞6 d,细胞培养上清纯化产物的相对分子质量约27 800,纯度达97.372%,且可与小鼠抗人IL-29/IFNλ1单克隆抗体发生特异性结合;反相HPLC检测分析可见2个峰,出峰时间分别为15.6和20.0 min;质谱分子量约为24 000;N-末端5个氨基酸序列为G-P-V-P-T。结论 HEK-293F细胞表达的rhIFNλ1纯度较高,为该蛋白的进一步研究奠定了基础。

F81细胞无血清悬浮驯化后培养猫泛白细胞减少症病毒的研究

为解决国内猫泛白细胞减少症生物制品短缺的问题,筛选出适用于猫泛白细胞减少症病毒增殖的猫肾细胞系(F81),通过对贴壁F81进行降血清悬浮驯化培养,得到了无血清全悬浮培养F81细胞系。研究建立的F81细胞系在初始传代细胞密度为1×10^(6)cells/mL时,培养48 h后细胞密度可达到7.02×10^(6)cells/mL。对培养猫泛白细胞减少症病毒工艺进行摸索,确定最佳接毒工艺为同步接毒法,初始接毒细胞密度为1×10^(6)cells/mL、MOI为3.5×10^(-2),培养72 h后收毒,病毒滴度可达到10^(7.25)TCID_(50)/0.1 mL。该方法使用同源细胞系且未添加动物血清,为猫泛白细胞减少症生物制品生产降低了下游生产纯化难度,同时降低了生产成本,可显著提高产品核心竞争力。研究结果可为其他猫用生物制品相关研究提供参考。